Bicyclus anynana pupa kanat dokusu gen ekspresyonu incelemek için, riboprobes kullanarak yerinde döllemeler için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Biz de bu protokolün diğer lepidopteran türlerin pupa kanatları kullanmak için daha fazla optimizasyon için yönergeler sağlar.
Abstract
Burada, video formatı, riboprobes kullanarak kelebek Bicyclus anynana pupa kanatları in situ döllemeler için bir protokol mevcut. Yerinde döllemeler, gelişim biyolojisi bir dayanak noktası, transkripsiyon düzeyinde, gelişmekte olan dokularda gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desen çalışması için faydalıdır. Gen transkripsiyonu ve protein ürünleri hedef alan antikorlar henüz geliştirilen ve / veya mevcut antikorlar kullanılarak ayırt edilemez genomunda belli bir protein birden fazla gen kopyaları bulunmaktadır edilmemiştir varsa, situs yerine kullanılabilir. Larva kanat diskler için yerinde teknik bir kaç yıl için kelebek topluluk olmasına karşın, mevcut protokol daha büyük ve daha kırılgan bir pupa kanatlar için optimize edilmiştir.
Protocol
1. GÜN Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: 10x PBS 1x PBS 1x PBT GKD 2 O % 0.1 'lik toplam hacmi DEPC ekleyin ve şiddetle çözümler sallamak. Otoklav. % 4 Paraformaldehit Fix – PBS-DEPC Proteinaz K çözüm çökelti varsa, vorteks şiddetle kısım çıkarmadan önce Sindirim Durdur Tamponu Prehybridization Tampon 50:50 PBT: Prehybridization Tampon Hibridizasy…
Discussion
Mevcut protokollerin optimizasyonu
Larva kanat disklerine yerinde döllemeler başarıyla Precis coenia kelebekler diskler kullanılarak yapılmıştır (Carroll ve ark 1994; Keys ve ark 1999; Weatherbee ve ark 1999). Protokolü larva kanat renklendirmeler Carroll Lab isteği üzerine ayrıntılı bir yazılı protokol adapte edilmiştir. Yapılan değişiklikler, larva ve pupa kanat dokular arasındaki farklılıkları barındırmak için hizmet vermektedir. Pupa hindwing diseksiyonlar sırasında peripodial membran kuyuları dahil…
Acknowledgements
Biz Jayne Selegue Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadiç Bob Reed, Roche Teknik Destek Bu protokol sorunları giderme konusunda yardım için teşekkür ederim. Biz de film düzenleme William Piel tavsiye için teşekkür ederim.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Fix Buffer
4% Paraformaldehyde in PBS
PBT
0.1% Tween 20 in PBS
Proteinase K solution
2.5g/ml Proteinase K in PBT
Digestion Stop Buffer
2 mg/ml glycine in PBT
Pre-Hybridization Buffer
For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
Hybridization Buffer
Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer
Block Buffer
50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA