तितली Pupal Riboprobes का उपयोग पंख के लिए स्वस्थानी प्रोटोकॉल में
Summary
आदेश में Bicyclus anynana pupal पंख ऊतक में जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, हम के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल सीटू riboprobes का उपयोग hybridizations में मौजूद है. हम भी अन्य Lepidopteran प्रजातियों के pupal पंखों में इस्तेमाल के लिए इस प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन के लिए दिशा निर्देश प्रदान करते हैं.
Abstract
यहाँ हम वीडियो प्रारूप में मौजूद है,, तितली Bicyclus anynana के pupal पंख riboprobes का उपयोग में सीटू hybridizations के लिए एक प्रोटोकॉल है. सीटू hybridizations में, विकास जीव विज्ञान के एक मुख्य आधार, प्रतिलेखन के स्तर पर ऊतकों के विकास में जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक और लौकिक पैटर्न के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं. यदि एंटीबॉडी कि लक्ष्य जीन प्रतिलेखन के प्रोटीन उत्पादों अभी तक विकसित नहीं किया गया है, और / या जीनोम है कि एंटीबॉडी का उपयोग उपलब्ध फर्क नहीं कर सकते में एक विशेष प्रोटीन के एकाधिक जीन प्रतियां हैं, बजाय situs में इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि लार्वा विंग डिस्क के लिए सीटू तकनीक में एक तितली समुदाय के लिए उपलब्ध कई वर्षों के लिए किया गया है, वर्तमान प्रोटोकॉल बड़ा और अधिक नाजुक pupal पंखों के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है.
Protocol
Discussion
मौजूदा प्रोटोकॉल का अनुकूलन
लार्वा विंग डिस्क पर सीटू hybridizations में सफलतापूर्वक किया गया है संक्षिप्त coenia तितलियों से डिस्क का उपयोग किया (कैरोल एट अल 1994, कुंजी एट अल 1999, Weatherbee एट अल 1999). वर्तमान प्रोटोकॉल कैरोल लैब स?…
Acknowledgements
हम Jayne Selegue, मार्गरेट Hollingsworth, जिन बेरी, Ryo Futahashi, Najmus सहार Mahfooz, Aleksandar Popadic, बॉब रीड, Roche इस प्रोटोकॉल की समस्या निवारण में मदद के लिए तकनीकी सहायता धन्यवाद. हम यह भी सलाह के लिए फिल्म संपादन पर विलियम PIEL धन्यवाद.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
Referências
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
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- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
