För att undersöka genuttryck i PUPP-flygeln vävnad Bicyclus anynana presenterar vi ett optimerat protokoll för in situ hybridizations med riboprobes. Vi ger också riktlinjer för ytterligare optimering av detta protokoll för användning i PUPP-vingar av andra ordningen fjärilar arter.
Abstract
Här presenterar vi, i videoformat, ett protokoll för in situ hybridizations i PUPP-vingar fjäril Bicyclus anynana med riboprobes. In situ hybridizations, en stöttepelare i utvecklingsbiologi, är användbara för att studera den rumsliga och tidsmässiga mönster av genuttryck för att utveckla vävnader i nivå med transkriptionen. Om antikroppar som riktar proteinet produkter gentranskription ännu inte har utvecklats, och / eller det finns flera gen kopior av ett visst protein i arvsmassan som inte kan differentieras med hjälp av tillgängliga antikroppar, kan i situs användas i stället. Medan en in situ teknik för larver vingen skivor har varit tillgängliga för fjäril gemenskapen under flera år, har den nuvarande protokollet är optimerad för de större och mer ömtåliga PUPP-vingar.
Protocol
DAG 1 Förbered följande lösningar: 10x PBS 1x PBS 1x PBT DDH 2 O Lägg DEPC för 0,1% total volym och skaka lösningar kraftigt. Autoklav. 4% Paraformaldehyd Fix – med hjälp av PBS-DEPC Proteinas K-lösning – om fällning närvarande, virvel kraftigt innan du tar bort alikvot Matsmältning Stoppa Buffer Prehybridization Buffer 50:50 PBT: Prehybridization Buffer Hybridi…
Discussion
Optimering av befintliga protokoll
In situ hybridizations på larver vinge skivor har framgångsrikt utförts med skivor från Precis coenia fjärilar (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999.). Det aktuella protokollet har anpassats från ett skriftligt detaljerat protokoll fås på begäran från Carroll Lab för larver vinge stainings. De förändringar vi gjort tjänar till att rymma skillnader mellan larver och PUPP-vinge vävnader. Under PUPP-hindwing dissektioner bör peripodial membranet tas bort och ing…
Acknowledgements
Vi tackar Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche tekniska support för hjälp med felsökning av detta protokoll. Vi tackar också William Piel för råd om att redigera filmen.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Fix Buffer
4% Paraformaldehyde in PBS
PBT
0.1% Tween 20 in PBS
Proteinase K solution
2.5g/ml Proteinase K in PBT
Digestion Stop Buffer
2 mg/ml glycine in PBT
Pre-Hybridization Buffer
For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
Hybridization Buffer
Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer
Block Buffer
50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA