In situ protokoll för Butterfly PUPP-Wings Använda Riboprobes
Summary
För att undersöka genuttryck i PUPP-flygeln vävnad Bicyclus anynana presenterar vi ett optimerat protokoll för in situ hybridizations med riboprobes. Vi ger också riktlinjer för ytterligare optimering av detta protokoll för användning i PUPP-vingar av andra ordningen fjärilar arter.
Abstract
Här presenterar vi, i videoformat, ett protokoll för in situ hybridizations i PUPP-vingar fjäril Bicyclus anynana med riboprobes. In situ hybridizations, en stöttepelare i utvecklingsbiologi, är användbara för att studera den rumsliga och tidsmässiga mönster av genuttryck för att utveckla vävnader i nivå med transkriptionen. Om antikroppar som riktar proteinet produkter gentranskription ännu inte har utvecklats, och / eller det finns flera gen kopior av ett visst protein i arvsmassan som inte kan differentieras med hjälp av tillgängliga antikroppar, kan i situs användas i stället. Medan en in situ teknik för larver vingen skivor har varit tillgängliga för fjäril gemenskapen under flera år, har den nuvarande protokollet är optimerad för de större och mer ömtåliga PUPP-vingar.
Protocol
Discussion
Optimering av befintliga protokoll
In situ hybridizations på larver vinge skivor har framgångsrikt utförts med skivor från Precis coenia fjärilar (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999.). Det aktuella protokollet har anpassats från ett skriftligt detaljerat protokoll fås på begäran från Carroll Lab för larver vinge stainings. De förändringar vi gjort tjänar till att rymma skillnader mellan larver och PUPP-vinge vävnader. Under PUPP-hindwing dissektioner bör peripodial membranet tas bort och ing…
Acknowledgements
Vi tackar Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche tekniska support för hjälp med felsökning av detta protokoll. Vi tackar också William Piel för råd om att redigera filmen.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
Referências
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
