שילוב של שלוש קצר פעמו לייזר באורך גל יחיד משמש ליצור פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) ומכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS). ההבדל בין אותות אלה מספק רגישות משופרת אחרת קשה לזהות אותות ראמאן קוהרנטית, המאפשר הדמיה של scatterers ראמאן חלש.
קוהירנט שיטות הדמיה ראמאן ראינו עלייה דרמטית בפעילות בעשור האחרון, בשל הבטחתם לאפשר ללא תווית הדמיה אופטית עם סגוליות גבוהה מולקולרית 1. הרגישות של טכניקות אלה, לעומת זאת, הזמנות רבות של עוצמת הקרינה חלשה יותר, המחייב מילי טוחנת מולקולרית 1,2 ריכוזי. כאן אנו מתארים טכניקה שיכולה לאפשר גילוי ריכוזים חלש או נמוך של ראמאן פעיל מולקולות על ידי הגברה האות שלהם עם זה המתקבל scatterers ראמאן חזק או עשיר. האינטראקציה של לייזרים של פולסים קצרים מדגם הביולוגי מייצר מגוון רחב של קוהרנטית אותות פיזור ראמאן, שכל אחד מהם לשאת מידע כימי ייחודי על המדגם. בדרך כלל, רק אחד האותות הללו, למשל פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS), משמש ליצירת תמונה בעוד אחרים מבוטלים. עם זאת, כאשר האותות הללו אחרים, כולל 3-צבע מכוניות ארבעה גל ערבוב (FWM), נאספים לעומת האות המכוניות, אחרת קשה לזהות מידע ניתן לחלץ 3. לדוגמה, מכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS) הוא תוצאה של התערבות בונה בין שני אותות התהודה 4. אנו מדגימים כיצד כוונון של שלוש לייזרים הנדרש כדי לייצר מכוניות DR-אותות 2845 הרטט -1 ס"מ למתוח CH שומנים לבין 2,120 -1 ס"מ תקליטור רטט מתיחה של מולקולה deuterated (סוכרים deuterated למשל, חומצות שומן, וכו ') יכול להיות מנוצל כדי בדיקה גם תהודות ראמאן בו זמנית. בתנאים אלה, בנוסף אותות מכוניות תהודה כל אות משולב DR-CARS חיטוט הן מופק גם. אנו מדגימים כיצד לזהות את ההבדל בין אות DR-המכוניות ואת האות הגברה של רעידות מולקולה של שפע יכול לשמש כדי לשפר את הרגישות לאות החלש. בנוסף, אנו מראים כי גישה זו אף מרחיב את יישומים בהם הן אותות נוצרות ממולקולות שונות, כך למשל באמצעות האות ראמאן חזקה של ממס יכול לשפר את האות ראמאן חלש של המומס לדלל.
ספקטרוסקופיית ראמאן ראמאן מבוססות הדמיה הם כלים חדשים רבי עוצמה בתחום מדעי ביו. נכון לעכשיו, זה נכון במיוחד עבור in vivo ו במחקר במבחנה של חילוף החומרים התאי והפרעות מטבוליות עיבוד ואחסון של שומנים. רוב ביו מקרומולקולות מכילים כמות גדולה של איגרות חוב דומות מולקולרית בעיקר מבוססי פחמן, כך ספקטרום ראמאן המתקבל תאים ואורגניזמים הם בדרך כלל פיתול של תרומות שומנים, חלבונים, חומצות גרעין, סוכרים, שומנים וכו 'קל יחסית כדי לבודד מן הספקטרום הללו מורכבים, בשל נטייתם טופס טיפות צפופה או bilayers ובגלל שהם מכילים שרשראות מורחבת עם מספר רב של אג"ח CH aliphatic. היכולת שלנו כדי לבודד חלבונים ספציפיים, חומצות אמינו, RNA או DNA בתוך הסביבה התאית מורכבת, עם זאת, מוגבלת מאוד. זה נכון במיוחד אם אלה מולקולות של עניין קיימים רק בריכוזים מיקרומטר ומטה. הנה, את היכולת לחקור תהודות ראמאן חלש ניצול הציג את החדשות שלנו DR-CARS הדמיה טכניקה ההבדל מספק גישה רב עוצמה פוטנציאלי עבור microanalysis הכימי שלהם הדמיה. אמנם, את החלק המסובך ביותר של פרוטוקול זה הוא יישור וסינכרון של מערכת לייזר. כאשר מתחיל מאפס, את הסנכרון של קטניות, כלומר להבטיח כי קטניות הן חופפות בזמן למרות מסלולים שונים שהם לוקחים ניתן להקל על ידי שימוש autocorrelator דופק. חפיפה מרחבית לאחר ובזמן מושגת, מכוניות DR-CARS אותות צריכה להתגלות בקלות. עם זאת, יישור הראשון הוא בדרך כלל בוטה, וכתוצאה מכך אותות חלשים. התרגול הטוב ביותר עבור יישור מערכת זו גם היא תחילה לייצר אותות חלשים ולאחר מכן על מנת לשפר את עוצמת האות על ידי tweaking בעדינות את המראות לאורך כל נתיב והתאמת חפיפה הזמני באמצעות בשלבים דיחוי. למרות ספקטרומטר / monochromator משמש לבלבל יעיל מאוד אור בחדר תוצאות הנקייה יכולה להיות מושגת על ידי מערכת ההפעלה עם האורות בחדר כבוי וילונות או צינורות העדשה כדי למזער רקע שהוצגו על ידי אור ממקורות שונים אחרים (כגון מסכי מחשב, חיווי אורות, נוריות וכו ').
ההגדרה שלנו בפרט מנצל פוטון יחיד מפולת צילום דיודה הספירה (APD) גלאי זמן בקורלציה ספירת חומרה פוטון יחיד (TCSPC) לאיתור 5. זה מאפשר לנו לזהות אותות חלשים מאוד עם רעש נמוך יחסית, אבל קבוצות רבות מצאו צילום מכפיל צינורות (PMT של) עם רווח משתנה יתרון בעת ביצוע מדידות דומות. היתרון של PMT היא שהם מציעים רווח משתנה ויש להם שטח זיהוי הרבה יותר גדול אשר יכול לפשט את היישור של הגלאי. בנוסף, ההגדרה שלנו מנצל בשלבים piezo לתרגם את המטרה על מנת להשיג סריקה הקורה. היתרון של זה היא שיש לנו את היכולת לחזור למקום כלשהו בתוך התמונה הסרוקה בעבר עם רמה גבוהה של דיוק לבצע מדידות נוספות כולל ספקטרום ראמאן ספונטנית. קבוצות אחרות הצליחו ניצול אסיפות ראי סריקה, או כל עוד יחידות סריקה confocal כגון מערכת אולימפוס FluoView, אשר מציע הדמיה הרבה יותר מהר, אך היא מוגבלת ביכולתה לחזור דווקא למקומות שרירותי בתוך תמונה.
כוונון לייזרים כדי להתאים את התהודה ראמאן גם שלב קריטי אשר יחייבו כמה אופטימיזציה. למרות הפסגות ראמאן יכול להיות ידוע את עוצמת מקסימום שיא הספקטרום המתקבל DR-מכוניות מכוניות לא בהכרח מתאימות לכל היותר הפסגה ראמאן ספונטנית. זאת בשל התערבות מהותית של אותות שנוצר על ידי ארבע גל ערבוב המוביל האות הלא מהדהד ברקע ומכוניות, אשר מעוות מכוניות ספקטרה יחסית ספקטרום ראמאן ספונטנית. המיקום הרפאים של השיא של האות המכוניות ניתן לחשב, אך גישה מעשית יותר היא לכוון את OPOs ב, כמה צעדים קטנים על פני הספקטרום המיקום הצפוי של התהודה ראמאן. תהליך זה אמור להניב מקסימום ברור. למעשה, על הרגישות הגדולה של DR-FWM תהודות הן חייב להיות מכוון למקסימום זה.
אחת הבעיות פוטנציאל האחרון הגישה DR-המכוניות יש גם לדון, כלומר את האות DR-CARS יהיה תלוי הפצה הומוגנית של המולקולה ראמאן פעיל הגברה. עבור אובייקטים ביולוגיים ביותר, זה יכול בהחלט להיות תהודה רחבה OH מן המים, שהוא בשפע בכל מקום כמעט. מים, לעומת זאת, מחוץ לאזורים הידרופובי עם תא, כגון טיפות השומנים, המוביל עיוות של האותות המתקבלים כאשר ניצול תהודה מים כדי להגביר מצבי השומנים. בדוגמה שלנו, השתמשנו פתרון של גלוקוז deuterated לייצר אות לזיהוי בקלות ובשפע למדגם הביולוגי שלנו. באופן דומה, deuterated מים או deuterated buffe ביולוגיrs, כגון d-HEPES יכול לשמש. בדוגמה שלנו, שומנים טיפות בתוך ג תולעת elegans היו קטנים מספיק כדי להכיל תמיד, הפתרון deuterated גלוקוז ושומנים בתוך המקום לייזר ממוקדת של המערכת שלנו. עם זאת, הוא בדרך כלל לא נכון. דוגמה מסוים יהיה adipocytes, אשר יוצרים טיפות השומנים די גדול בתוך הציטופלסמה שלהם. זאת אומרת, כל ניסוי שנערך עם טכניקה DR-המכוניות מצריכה הכנה קפדנית וניסיונות לשלוט כדי לאמת את התוצאות.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות Iwan נהר הסכי וסבסטיאן וקסמן-Hogiu על תרומתם בפיתוח טכניקה DR-מכוניות. השבועות טיילר מודה תמיכה על ידי תוכנית Scholar לורנס מן המעבדה הלאומית לורנס ליברמור. תומאס Huser הוא אסיר תודה על התמיכה של איגוד הלב האמריקני באמצעות תוכנית גרנט-in-Aid. עבודה זו נתמכה גם על ידי מימון הקרן הלאומית למדע בחלקו. המרכז Biophotonics, מדע וטכנולוגיה NSF המרכז, המנוהל על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, על פי הסכם שיתופית מס '0120999 PHY. תמיכה הוא הודה גם מהמרכז UCD המדע קלינית Translational תחת מספר מענק UL1 RR024146 מן המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |