तीन एकल तरंगदैर्ध्य लघु स्पंदित लेसरों का एक संयोजन के लिए सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन (कारों) बिखरने और दोगुना गुंजयमान कारों (डॉ कारों -) उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अन्यथा सुसंगत रमन संकेतों का पता लगाने के लिए मुश्किल के लिए इन संकेतों के बीच का अंतर बढ़ाकर संवेदनशीलता प्रदान करता है, कमजोर रमन scatterers की इमेजिंग सक्षम है.
Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging with high molecular specificity 1. The sensitivity of these techniques, however, is many orders of magnitude weaker than fluorescence, requiring milli-molar molecular concentrations 1,2. Here, we describe a technique that can enable the detection of weak or low concentrations of Raman-active molecules by amplifying their signal with that obtained from strong or abundant Raman scatterers. The interaction of short pulsed lasers in a biological sample generates a variety of coherent Raman scattering signals, each of which carry unique chemical information about the sample. Typically, only one of these signals, e.g. Coherent Anti-stokes Raman scattering (CARS), is used to generate an image while the others are discarded. However, when these other signals, including 3-color CARS and four-wave mixing (FWM), are collected and compared to the CARS signal, otherwise difficult to detect information can be extracted 3. For example, doubly-resonant CARS (DR-CARS) is the result of the constructive interference between two resonant signals 4. We demonstrate how tuning of the three lasers required to produce DR-CARS signals to the 2845 cm-1 CH stretch vibration in lipids and the 2120 cm-1 CD stretching vibration of a deuterated molecule (e.g. deuterated sugars, fatty acids, etc.) can be utilized to probe both Raman resonances simultaneously. Under these conditions, in addition to CARS signals from each resonance, a combined DR-CARS signal probing both is also generated. We demonstrate how detecting the difference between the DR-CARS signal and the amplifying signal from an abundant molecule’s vibration can be used to enhance the sensitivity for the weaker signal. We further demonstrate that this approach even extends to applications where both signals are generated from different molecules, such that e.g. using the strong Raman signal of a solvent can enhance the weak Raman signal of a dilute solute.
रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और रमन आधारित इमेजिंग जैव विज्ञान में शक्तिशाली उभरते उपकरण हैं. वर्तमान में, यह और vivo में इन विट्रो अध्ययन में और प्रसंस्करण और lipids की भंडारण में सेलुलर चयापचय चयापचय विकारों के लिए विशेष रूप से सच है. हाल जैव अणुओं के समान है, ज्यादातर कार्बन आधारित आणविक बांड की एक बड़ी संख्या में होते हैं, ताकि रमन स्पेक्ट्रा कोशिकाओं और जीवों से प्राप्त आम तौर पर lipids, प्रोटीन, nucleic एसिड, शर्करा से योगदान की एक कनवल्शनफ़िल्टर्स हैं, Lipids आदि अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं इन जटिल स्पेक्ट्रा से उनके घने बूंदों या bilayers फार्म की प्रवृत्ति की वजह से और क्योंकि वे aliphatic सीएच बांड की एक बड़ी संख्या के साथ विस्तारित श्रृंखला होते हैं, अलग. हमारी जटिल सेलुलर पर्यावरण के भीतर विशिष्ट प्रोटीन, अमीनो एसिड, शाही सेना, या डीएनए को अलग करने की क्षमता है, तथापि, बहुत ही सीमित है. यह विशेष रूप से सच है अगर ब्याज की इन अणुओं के केवल सुक्ष्ममापी सांद्रता में मौजूद है और नीचे हैं. यहाँ, कमजोर रमन हमारे नव शुरू DR-कारों अंतर इमेजिंग तकनीक का उपयोग अनुनादों जांच करने की क्षमता उनकी रासायनिक microanalysis और इमेजिंग के लिए एक संभावित शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है. बेशक, इस प्रोटोकॉल के सबसे जटिल भाग संरेखण और लेजर प्रणाली के तुल्यकालन है. जब खरोंच से शुरू करने, दालों के तुल्यकालन, यानी यह सुनिश्चित करना है कि दालों समय में अलग अलग रास्तों वे ले एक नाड़ी autocorrelator के उपयोग से मदद की जा सकती बावजूद छा जाता है. एक बार स्थानिक और लौकिक ओवरलैप हासिल है, कारों और DR-कारों के संकेतों को आसानी से detectable होना चाहिए. हालांकि, पहले संरेखण अक्सर, कच्चे तेल में कमजोर संकेतों में जिसके परिणामस्वरूप. इस प्रणाली अच्छी तरह से aligning के लिए सबसे अच्छा अभ्यास करने के लिए शुरू कमजोर संकेतों को उत्पन्न करने के लिए और फिर प्रत्येक मार्ग के किनारे धीरे दर्पण tweaking और लौकिक देरी चरणों का उपयोग ओवरलैप समायोजन द्वारा सिग्नल की शक्ति में सुधार है. हालांकि स्पेक्ट्रोमीटर / monochromator कृत्यों कमरे के प्रकाश के लिए एक बहुत ही कुशल भ्रमित के रूप में साफ परिणाम कमरे में रोशनी के साथ ऑपरेटिंग सिस्टम के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है बंद कर दिया और पर्दे या लेंस टयूबिंग विभिन्न अन्य प्रकाश स्रोतों (जैसे कंप्यूटर पर नज़र रखता है के द्वारा शुरू की पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, सूचक रोशनी, एल ई डी, आदि).
हमारे विशेष सेटअप एकल फोटॉन गिनती हिमस्खलन फोटो डायोड (APD) डिटेक्टरों और समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) का पता लगाने के लिए 5 हार्डवेयर का इस्तेमाल करता है. यह अपेक्षाकृत कम शोर है, लेकिन कई समूहों चर फायदेमंद लाभ जब समान माप बनाने के साथ फोटो गुणक ट्यूब (PMT) मिल गया है के साथ हमें बेहद कमजोर संकेतों का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है. PMT है के लाभ यह है कि वे चर लाभ प्रदान करते हैं और एक बहुत बड़ा का पता लगाने क्षेत्र है जो डिटेक्टर के संरेखण को सरल कर सकते है. इसके अतिरिक्त, हमारे सेटअप piezo चरणों का इस्तेमाल करने के लिए उद्देश्य अनुवाद के क्रम में बीम स्कैनिंग हासिल है. इस का लाभ यह है कि हम पहले से स्कैन की गई छवि के भीतर सटीकता की एक उच्च डिग्री के साथ किसी भी स्थान के लिए और वापस सहज रमन स्पेक्ट्रा सहित अतिरिक्त माप लेने की क्षमता है. अन्य समूहों सफल स्कैनिंग विधानसभाओं दर्पण, या यहाँ तक कि पूरे ओलिंप FluoView सिस्टम है, जो बहुत तेजी से इमेजिंग प्रदान करता है, लेकिन इसके ठीक एक छवि के भीतर मनमाना स्थानों पर लौटने की क्षमता में सीमित है जैसे confocal स्कैनिंग इकाइयों का उपयोग किया गया है.
ट्यूनिंग लेज़रों मैच रमन अनुनाद भी एक महत्वपूर्ण कदम है कि कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. हालांकि रमन चोटियों अधिकतम वर्णक्रमीय चोटी DR-कारों और कारों से प्राप्त तीव्रता जाना हो सकता है जरूरी सहज रमन चोटी के अधिकतम करने के लिए अनुरूप नहीं है. यह चार लहर एक गैर गुंजयमान पृष्ठभूमि सिगनल और कारों, जो कारों सहज रमन स्पेक्ट्रा रिश्तेदार स्पेक्ट्रा distorts अग्रणी मिश्रण द्वारा उत्पन्न संकेतों के आंतरिक हस्तक्षेप के कारण है. कारों संकेत के चोटी के वर्णक्रमीय स्थान, गणना की जा सकती है लेकिन एक और अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण रमन अनुनाद की उम्मीद स्थान भर में कई छोटे वर्णक्रमीय चरणों में OPOs धुन है. यह प्रक्रिया एक स्पष्ट अधिकतम उपज चाहिए. वास्तव में, दोनों अनुनादों DR-FWM से सबसे बड़ी संवेदनशीलता के लिए इस अधिकतम करने के लिए tuned किया जाना चाहिए.
एक दृष्टिकोण डॉ कारों – के अंतिम संभावित समस्या पर भी विचार – विमर्श हो गया है, यानी संकेत डॉ कारों रमन सक्रिय amplifying अणु के एक सजातीय वितरण पर निर्भर करेगा. सबसे जैविक वस्तुओं के लिए, यह अच्छी तरह से पानी से व्यापक OH प्रतिध्वनि है, जो प्रचुर मात्रा में है और लगभग सर्वव्यापी हो सकता है. जल है, तथापि, हाइड्रोफोबिक लिपिड बूंदों के रूप में एक सेल के साथ, क्षेत्रों, अग्रणी प्राप्त है जब पानी अनुनाद का उपयोग करने के लिए लिपिड मोड बढ़ाना संकेतों के एक विकृति से बाहर रखा गया है. हमारे उदाहरण में, हम deuterated ग्लूकोज के एक समाधान का इस्तेमाल किया है हमारे जैविक नमूने के लिए एक और आसानी से detectable और प्रचुर मात्रा में संकेत उत्पन्न. इसी तरह, पानी deuterated या जैविक buffe deuteratedरुपये, D-HEPES जैसे इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे उदाहरण में, सी. के भीतर लिपिड बूंदों एलिगेंस कीड़ा काफी छोटे हमेशा हमारे सिस्टम का ध्यान केंद्रित लेजर हाजिर के भीतर दोनों deuterated ग्लूकोज समाधान और lipids शामिल थे . तथापि, यह आमतौर पर सच नहीं है. एक विशिष्ट उदाहरण adipocytes, जो अपने भीतर cytoplasm बल्कि बड़ी लिपिड बूंदों उत्पन्न होगा. इसका मतलब है, किसी भी तकनीक डॉ कारों के साथ किए गए प्रयोग सावधान तैयारी और नियंत्रण प्रयोगों के परिणामों को सत्यापित करने की आवश्यकता है.
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीक DR-कारों के विकास में उनके योगदान के लिए Iwan Schie और Wachsmann Hogiu सेबस्टियन धन्यवाद देना चाहूंगा. टायलर सप्ताह से लॉरेंस लिवरमोर राष्ट्रीय प्रयोगशाला लॉरेंस विद्वान प्रोग्राम द्वारा समर्थन मानता है. थॉमस Huser में सहायता अनुदान कार्यक्रम के माध्यम से अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से समर्थन के लिए आभारी है. यह काम भी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से धन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था. सहकारी समझौते सं बनावट 0120999 के तहत, Biophotonics, एक NSF विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र के लिए केंद्र कैलिफोर्निया, डेविस के विश्वविद्यालय द्वारा प्रबंधित है. समर्थन भी UCD क्लीनिकल translational अनुसंधान संसाधन (NCRR) के लिए राष्ट्रीय केन्द्र से अनुदान UL1 संख्या RR024146 के तहत विज्ञान केंद्र से स्वीकार किया है.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |