विभेदकों इमेजिंग जैविक संरचनाओं की दोगुना गुंजयमान सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन छितराया (कारों) के साथ

Summary

तीन एकल तरंगदैर्ध्य लघु स्पंदित लेसरों का एक संयोजन के लिए सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन (कारों) बिखरने और दोगुना गुंजयमान कारों (डॉ कारों -) उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अन्यथा सुसंगत रमन संकेतों का पता लगाने के लिए मुश्किल के लिए इन संकेतों के बीच का अंतर बढ़ाकर संवेदनशीलता प्रदान करता है, कमजोर रमन scatterers की इमेजिंग सक्षम है.

Abstract

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging with high molecular specificity ¹. The sensitivity of these techniques, however, is many orders of magnitude weaker than fluorescence, requiring milli-molar molecular concentrations ^1,2. Here, we describe a technique that can enable the detection of weak or low concentrations of Raman-active molecules by amplifying their signal with that obtained from strong or abundant Raman scatterers. The interaction of short pulsed lasers in a biological sample generates a variety of coherent Raman scattering signals, each of which carry unique chemical information about the sample. Typically, only one of these signals, e.g. Coherent Anti-stokes Raman scattering (CARS), is used to generate an image while the others are discarded. However, when these other signals, including 3-color CARS and four-wave mixing (FWM), are collected and compared to the CARS signal, otherwise difficult to detect information can be extracted ³. For example, doubly-resonant CARS (DR-CARS) is the result of the constructive interference between two resonant signals ⁴. We demonstrate how tuning of the three lasers required to produce DR-CARS signals to the 2845 cm^-1 CH stretch vibration in lipids and the 2120 cm^-1 CD stretching vibration of a deuterated molecule (e.g. deuterated sugars, fatty acids, etc.) can be utilized to probe both Raman resonances simultaneously. Under these conditions, in addition to CARS signals from each resonance, a combined DR-CARS signal probing both is also generated. We demonstrate how detecting the difference between the DR-CARS signal and the amplifying signal from an abundant molecule’s vibration can be used to enhance the sensitivity for the weaker signal. We further demonstrate that this approach even extends to applications where both signals are generated from different molecules, such that e.g. using the strong Raman signal of a solvent can enhance the weak Raman signal of a dilute solute.

Protocol

1. कारों और डॉ कारों के सिग्नल की पीढ़ी आदेश में कारों उत्पन्न करने के लिए और डॉ कारों के संकेतों को एक साथ, तीन tunable और सिंक्रनाइज़ कम स्पंदित लेजर स्रोतों आवश्यक हैं. तीन सिंक्रनाइज़ दालों हम एक एकल 10 डब्ल्यू लेजर (PicoTrain, HighQ लेजर, इंक) के साथ शुरू प्राप्त करने के लिए. इस लेजर 1064 एनएम के एक निश्चित तरंग दैर्ध्य, 7 पी एस की एक निश्चित नाड़ी लंबाई, और 76 मेगाहर्ट्ज के एक निश्चित पुनरावृत्ति दर है. आधे लहर प्लेटों की एक श्रृंखला का उपयोग और बीम फाड़नेवाला ध्रुवीकरण क्यूब्स बीम को तीन भागों में विभाजित है. एक आधे लहर एक polarizing बीम फाड़नेवाला क्यूब के साथ संयुक्त थाली हमें अपनी दिशा बदलने के बिना बीम के प्रत्येक घटक में सत्ता की राशि को समायोजित करने के लिए अनुमति देता है. आमतौर पर, दो मुस्कराते हुए ~ 4.5 डब्ल्यू प्रत्येक समायोजित कर रहे हैं, और तीसरे बीम शेष 1 डब्ल्यू शामिल दो उच्च शक्ति बीम तो दो स्वतंत्र ऑप्टिकल पैरामीट्रिक oscillators (OPO, Avante, बंदर, GmbH बर्लिन, जर्मनी) में निर्देशित कर रहे हैं. OPO उपयोग अंतर आवृत्ति करने के लिए दो कम ऊर्जा photons में विभिन्न तरंगदैर्य के साथ एक उच्च ऊर्जा फोटॉन कन्वर्ट पीढ़ी. इस प्रभाव को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया क्रिस्टल के तापमान को नियंत्रित करके, जिसके परिणामस्वरूप फोटॉनों की तरंग दैर्ध्य 0.1 एनएम के भीतर नियंत्रित किया जा सकता है. आवृत्ति दोहरीकरण इन संकेतों, 1064 एनएम के एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के साथ एक लेजर अब एक लेजर बीम है कि 780 एनएम से 910 एनएम के बीच कहीं भी देखते जा सकता है में तब्दील किया जा सकता है. एक ही 1064 एनएम स्रोत के साथ दो अलग – अलग OPO है पम्पिंग करके, हम दो स्वतंत्र tunable लेजर स्रोत है कि स्वचालित रूप से हमारे मूल पंप लेजर सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं प्राप्त करते हैं. 1064 एनएम लेजर पंप से तीसरे (कम शक्ति) बीम OPO के आसपास dichroic दर्पण है ताकि बाद में सभी तीन बीम (2 लेजर पंप से, OPOs 1 से) recombined जा सकता है का एक संयोजन द्वारा निर्देशित है. आदेश में कुशलतापूर्वक सुसंगत रमन संकेत फोटॉनों का उत्पादन recombined दालों दोनों अस्थायी और spatially छा जाना चाहिए. क्योंकि OPO अंगूठी cavities के होते हैं, प्रत्येक नाड़ी लेजर क्रिस्टल कई बार के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देता है, OPO यात्रा के माध्यम से एक अतिरिक्त एक काफी मूल पंप बीम रिश्तेदार देरी में जिसके परिणामस्वरूप दूरी भेजा मुस्कराते हुए. तीसरे किरण के साथ यह दूरी के लिए अतिरिक्त दर्पण है कि इस बीम अन्य दो के रूप में एक ही दूरी की यात्रा करने के लिए इससे पहले कि वे dichroic दर्पण का उपयोग recombined हैं बल को शुरू करने के द्वारा मुआवजा किया जाना चाहिए. आदेश में प्रत्येक बीम समायोज्य देरी चरणों, चश्मे retroreflectors का उपयोग कर यात्रा पथ की लंबाई के ठीक समायोजन, प्रत्येक किरण पथ में पेश कर रहे हैं प्रदान करने के लिए. आधे लहर प्लेटें और ध्रुवीकरण बीम फाड़नेवाला क्यूब्स का एक और सेट प्रत्येक बीम को जोड़ रहे हैं हमें OPO है इनपुट को प्रभावित किए बिना स्वतंत्र रूप से प्रत्येक बीम की शक्ति को समायोजित करने की अनुमति. Dichroic दर्पण पहले दो OPO है और 1064 एनएम बीम के साथ फिर से मुस्कराते हुए गठबंधन के लिए उपयोग किया जाता है. देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि मुस्कराते हुए ठीक छा रहे हैं (यानी वे समरेख हैं और इसी तरह की विचलन है) के लिए लिया जाना चाहिए. यह (~ 1 मीटर) dichroic दर्पण से मुस्कराते हुए ओवरलैप के करीब कुछ सेंटीमीटर के भीतर () और दूर की तुलना द्वारा जाँच की जा सकती है. स्पंदित लेसरों का उपयोग करने का लाभ यह है कि प्रत्येक नाड़ी नमूना पर एक ऊंची चोटी ऊर्जा है, सुसंगत रमन संकेतों के कुशल पीढ़ी के लिए अनुमति देता है कर सकते हैं, जबकि अभी भी एक कम औसत तीव्रता को बनाए रखने. एक उच्च औसत तीव्रता नमूना नुकसान पहुंचा सकता है. इसलिए, क्रम में आगे पीक ऊर्जा त्याग के बिना औसत तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए, तीन संयुक्त मुस्कराते हुए एक इलेक्ट्रो ऑप्टिक (Pockel सेल, ConOptics) एक नाड़ी पिकर है, जो हमें दालों कि पुनरावृत्ति की दर को समायोजित करने की अनुमति देता है के रूप में न्यूनाधिक कामकाज के माध्यम से भेजा जाता है हमारे नमूना पर पहुंचने और इसलिए औसत तीव्रता. संयुक्त लेजर बीम तो एक उच्च एनए उद्देश्य के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप में मिलकर कर रहे हैं. उद्देश्य आम तौर पर 1.2 की एक संख्यात्मक एपर्चर (एनए) है कि हमारे OPO के tunability और 1064 एनएम बीम की सीमा के पार रंगीन विपथन के लिए सही किया गया है के साथ 60 एक्स पानी उद्देश्य लेंस है. ध्यान केंद्रित तंग उच्च एनए उद्देश्य लेंस द्वारा उत्पन्न माइक्रोन पैमाने पर सुसंगत रमन संकेतों के सबसे कुशल पीढ़ी के लिए अनुमति देता है. संयुक्त मुस्कराते हुए क्रम में खुर्दबीन उद्देश्य के पीछे बंदरगाह उमड़ाना विस्तार कर रहे हैं. खुर्दबीन उद्देश्य के वापस overfilling हम सबसे अच्छा ध्यान केंद्रित शर्तों को प्राप्त करने और इसलिए हमारे खुर्दबीन प्रणाली में सबसे अच्छा स्थानिक संकल्प कर सकते हैं. हमारे खुर्दबीन उद्देश्य लेंस में एक XYZ piezo मंच है जो हमें नमूना भर में मुस्कराते हुए, वाणिज्यिक बीम स्कैनिंग confocal सूक्ष्मदर्शी के लिए इसी तरह की रेखापुंज स्कैनिंग करके छवियों को प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है पर मुहिम शुरू की है. 2. तीन लघु स्पंदित लेजर का प्रयोग करें तीन छोटे कई कारों के संकेतों के उत्पादन में स्पंदित लेसरों परिणामों के विभिन्न ग से उपयोगदो लेज़रों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 3 – रंग कारों और सभी तीन लेज़रों के संयोजन से डॉ FWM संकेतों की ombinations. संकेतों की तरंग दैर्ध्य spectrally एक दूसरे के करीब झूठ कर सकते हैं. जब संकेतों करीब एक साथ कर रहे हैं यह निश्चित तरंग दैर्ध्य bandpass फिल्टर और dichroic दर्पण का उपयोग करते हुए विश्लेषण के लिए उन्हें अलग करना मुश्किल हो सकता है. इस कारण से हमारे संकेतों को एक इमेजिंग स्पेक्ट्रोमीटर (SpectraPro 2300i, एक्टन अनुसंधान) भी है कि एक कुशल monochromator के रूप में कार्य करता है spatially विभिन्न तरंगदैर्य पर संकेतों को अलग करने में पारित कर रहे हैं. एक इलेक्ट्रॉनिक actuated उतारा स्थिति में स्पेक्ट्रोमीटर के भीतर फ्लिप दर्पण वापस प्रबुद्ध गहरे – रिक्तीकरण आरोप डिवाइस युग्मित (सीसीडी) कैमरा है जो पूरे संकेत रेंज भर में स्पेक्ट्रोस्कोपी जानकारी प्रदान करता है संकेत भेजता है और हमें पहचान करने और सुसंगत विभिन्न अनुकूलन की अनुमति देता है रमन संकेतों. संकेत है जिसके साथ हम छवि के लिए चाहते हैं का चयन करने के लिए हम बस स्पेक्ट्रोमीटर के भीतर झंझरी घुमाने के लिए, और विक्रेता आपूर्ति नियंत्रण और डाटा अधिग्रहण (WinSpec, प्रिंसटन उपकरण) सॉफ्टवेयर, केंद्र के लिए सीसीडी कैमरा पर ब्याज के शिखर का उपयोग तो बदल फ्लिप दर्पण की स्थिति के लिए एक दूसरे से बाहर निकलें बंदरगाह जो एक एकल फोटॉन गिनती फोटो डायोड हिमस्खलन (APD) संलग्न किया गया है इस संकेत को अनुप्रेषित. उद्देश्य लेंस तो रेखापुंज स्कैन और APD पर दर्ज संकेतों को प्रत्येक पिक्सेल के लिए डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (SymPhoTime, Picoquant GmbH, बर्लिन, जर्मनी) के माध्यम से गिनती दर फोटोन प्रदर्शित करके एक छवि को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है. हम प्रत्येक वांछित सुसंगत रमन संकेत है जो हमें पोस्ट प्रोसेसिंग के दौरान संकेतों की तुलना करने के लिए अनुमति देता है के लिए इस इमेजिंग प्रक्रिया को दोहराएँ. 3. नमूना तैयार आदेश में स्पष्ट, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य छवियों को प्राप्त करने के लिए कुछ ध्यान नमूना तैयारी में लिया जाना चाहिए. नमूने आमतौर पर ~ 150 माइक्रोन मोटी कांच coverslips पर तैयार कर रहे हैं. ये coverslips काफी पतली 1.2 एनए उद्देश्य है कि आम तौर पर उपयोग किया जाता है के साथ उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए कर रहे हैं. जब लेज़र प्रकाश छोटे पारदर्शी वस्तुओं के माध्यम से diffracted है ढांकता हुआ वस्तुओं की ऑप्टिकल फँसाने हो सकता है. कसकर केंद्रित, ऊंची चोटी शक्ति का उपयोग, लघु स्पंदित लेजर बीम तो छोटे कोशिकाओं के साथ या बैक्टीरिया को खींच कर सकते हैं, धुंधला या लिप्त छवियों में जिसके परिणामस्वरूप. आदेश में इस से बचने के के लिए यह आवश्यक हो कांच coverslip की सतह पर पहली बार स्पिन कोटिंग के द्वारा पाली – एल Lysine की एक पतली परत लागू करने के द्वारा नमूना स्थिर हो सकता है. संस्कृति में कोशिकाओं के लिए गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन का उपयोग हो सकता है कि करने के लिए अपने सेल संस्कृति के विकास के व्यंजनों से कोशिकाओं को अलग करने की आवश्यकता के बिना इमेजिंग के लिए अनुमति दे सकते हैं. इस योगदान में प्रदर्शन के लिए हम पहले एक formaldehyde तय सी. जमा एक गिलास कवर पर्ची पर एलिगेंस निमेटोड कीड़ा. फिर एक 20 5 एम deuterated ग्लूकोज कीड़ा के समाधान के μL छोटी बूंद जोड़ें. deuterated ग्लूकोज समाधान एक अद्वितीय और मजबूत रमन पृष्ठभूमि हस्ताक्षर प्रदान करता है. 4. नमूना विश्लेषण दोनों रमन गुंजयमान पदार्थों के रमन स्पेक्ट्रा के क्रम में ठीक दोगुना गुंजयमान वृद्धि के प्रभाव का लाभ लेने के लिए जाना जाता है. एक बार नमूना coverslip यह विश्लेषण किया है एक confocal रमन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए प्रासंगिक सहज रमन स्पेक्ट्रम प्राप्त करने और उपयुक्त चोटियों की पहचान पर तैयार की है. डॉ – कारों हम दर्पण खिंचाव मोड, आम तौर पर लिपिड के साथ जुड़े, और सीडी खिंचाव मोड के वर्णक्रमीय स्थानों की पहचान, deuterated ग्लूकोज के साथ जुड़े, 2845 सेमी -1 और 2121 सेमी -1 क्रमशः प्रदर्शन करने के लिए. सुसंगत रमन प्रकीर्णन हासिल की है जब दो लेज़रों के बीच अंतर आवृत्ति एक आणविक कंपन की आवृत्ति से मेल खाता है. ट्यूनिंग एक 817 एनएम के लिए OPO तक यह 2845 सेमी -1 सीएच मोड जब 1064 एनएम लेजर बीम के साथ और यह 2121 सेमी -1 चोटी जांच जब 1064 एनएम बीम के साथ संयुक्त 868 एनएम अन्य OPO ट्यूनिंग द्वारा संयुक्त जांच . करके रेखापुंज कारों खुर्दबीन अब हम ब्याज की तीन सुसंगत रमन संकेतों का पालन कर सकते हैं पर नमूना स्कैनिंग. एक कारों कंपन खींच सीएच जांच संकेत, एक सीडी खिंचाव मोड, और डॉ कारों दोनों जांच संकेत जांच कारों संकेत. हम प्रत्येक चोटी का चयन करें जैसा कि खंड 2.3 में वर्णित है और ऊपर वर्णित के रूप में एक छवि ले. 5. छवि प्रसंस्करण इन तीन छवियों पर आधारित अतिरिक्त जानकारी एक्स्ट्रेक्टिंग अब कुछ काफी सरल छवि प्रसंस्करण की आवश्यकता है. पहले छवियों सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. सिद्धांत के सामान्य में प्रत्येक संकेत पीढ़ी की प्रक्रिया में शामिल प्रत्येक लेजर की तीव्रता के लिए लेखांकन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. अभ्यास में, लेकिन यह हमेशा नहीं काम करता है मुख्य रूप से गैर वर्दी वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया करने के लिए कारणdichroic दर्पण, डिटेक्टरों, और gratings के. सामान्य के लिए एक व्यावहारिक विधि के तथ्य यह है कि जहां शुद्ध लिपिड संकेत हावी क्षेत्रों में, सीडी अनुनाद किसी भी संकेत के लिए नहीं योगदान देना चाहिए पर निर्भर करता है. इसी तरह, दर्पण अनुनाद शुद्ध ग्लूकोज समाधान के क्षेत्रों में किसी भी संकेत के लिए नहीं योगदान देना चाहिए. मन में इस के साथ, हम छवि डॉ कारों और कारों छवि deuterated ग्लूकोज सी. बाहर एक अच्छी तरह से क्षेत्र के लिए समाधान की सीडी अनुनाद पर प्राप्त सामान्य एलिगेंस कीड़ा है कि कोई दर्पण अनुनाद एक्ज़िबिट चाहिए. तो फिर हम कीड़ा भीतर दर्पण गुंजयमान कारों छवि है कि lipids में समृद्ध है में एक क्षेत्र और पहचान सामान्यीकृत छवि DR-कारों के भीतर इसी क्षेत्र के लिए यह सामान्य है. इस विधि को ठीक से काम करने के लिए हम मान लें कि इस क्षेत्र के भीतर गहरे कोई deuterated ग्लूकोज मौजूद है. यह एक सुरक्षित धारणा है के बाद से लिपिड hydrophobic रहे हैं और समाधान के साथ मिश्रण नहीं होगा. अब, सामान्यीकृत छवि DR-कारों से सामान्यीकृत दर्पण गुंजयमान कारों छवि subtracting द्वारा हम सिर्फ प्रवर्धित सीडी गुंजयमान संकेत के साथ छोड़ दिया जाता है. सामान्यीकृत छवि DR-FWM से सामान्यीकृत सीडी गुंजयमान कारों छवि subtracting द्वारा इसी तरह हम सिर्फ प्रवर्धित CH-गुंजयमान संकेत के साथ छोड़ दिया जाता है. 6. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1: डॉ कारों माइक्रोस्कोपी प्रणाली के रूप में ऊपर वर्णित का आरेख. चित्रा 2: एक सी. के व्हाइट प्रकाश छवि deuterated ग्लूकोज समाधान में एलिगेंस कीड़ा एक गिलास coverslip पर तैयार और इमेजिंग के लिए तैयार है . चित्रा 3: संशोधित ओलिक एसिड (एक असंतृप्त फैटी एसिड) है कि एक alkyne संशोधन (एक कार्बन कार्बन ट्रिपल बंधन समूह) भी शामिल है के रमन स्पेक्ट्रम +२,८४५ -1 सेमी और 2100 सेमी पर alkyne अनुनाद पर मजबूत सीएच अनुनादों -1 दोनों हैं अच्छी तरह से फिंगरप्रिंट क्षेत्र (घनी पैक चोटियों के क्षेत्र) से अलग है, उन्हें सुसंगत रमन इमेजिंग के लिए आदर्श मार्करों बनाने. चित्रा 4: सुसंगत रमन उत्पन्न जब तीन लघु स्पंदित लेसरों नमूना भीतर छा रहे हैं संकेतों के ठेठ स्पेक्ट्रम के तीर (ते) प्रत्येक संकेत के रूप में ऊर्जा आरेख द्वारा प्रतिनिधित्व के लिए जिम्मेदार प्रक्रिया को इंगित. यहाँ दिखाया गया चित्र में धराशायी तीर लेजर और OPO और ठोस तीर से फोटॉनों से संकेत मिलता है परिणामस्वरूप संकेत संकेत मिलता है. ठोस क्षैतिज लाइनों रमन कंपन की ऊर्जा से संकेत मिलता है और एक दृश्य प्रतिनिधित्व है कि डॉ कारों में, एक ही तीन इनपुट फोटॉनों मिश्रण एक साथ दो अलग रमन कंपन जांच दे. चित्रा 5: इमेजिंग सी. से ठेठ परिणाम एलिगेंस DR-कारों और कारों का उपयोग कीड़े शीर्ष पंक्ति में तीन चित्रा 4 में संकेत संकेतों का इस्तेमाल deuterated ग्लूकोज की एक समाधान में एक कीड़ा छवि. दूसरी पंक्ति में छवियों को उचित सामान्यीकृत और तीसरी पंक्ति में अंतर छवियों छवि डॉ कारों से कारों की प्रत्येक छवियों subtracting द्वारा उत्पादित थे.

Discussion

रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और रमन आधारित इमेजिंग जैव विज्ञान में शक्तिशाली उभरते उपकरण हैं. वर्तमान में, यह और vivo में इन विट्रो अध्ययन में और प्रसंस्करण और lipids की भंडारण में सेलुलर चयापचय चयापचय विकारों के लिए विशेष रूप से सच है. हाल जैव अणुओं के समान है, ज्यादातर कार्बन आधारित आणविक बांड की एक बड़ी संख्या में होते हैं, ताकि रमन स्पेक्ट्रा कोशिकाओं और जीवों से प्राप्त आम तौर पर lipids, प्रोटीन, nucleic एसिड, शर्करा से योगदान की एक कनवल्शनफ़िल्टर्स हैं, Lipids आदि अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं इन जटिल स्पेक्ट्रा से उनके घने बूंदों या bilayers फार्म की प्रवृत्ति की वजह से और क्योंकि वे aliphatic सीएच बांड की एक बड़ी संख्या के साथ विस्तारित श्रृंखला होते हैं, अलग. हमारी जटिल सेलुलर पर्यावरण के भीतर विशिष्ट प्रोटीन, अमीनो एसिड, शाही सेना, या डीएनए को अलग करने की क्षमता है, तथापि, बहुत ही सीमित है. यह विशेष रूप से सच है अगर ब्याज की इन अणुओं के केवल सुक्ष्ममापी सांद्रता में मौजूद है और नीचे हैं. यहाँ, कमजोर रमन हमारे नव शुरू DR-कारों अंतर इमेजिंग तकनीक का उपयोग अनुनादों जांच करने की क्षमता उनकी रासायनिक microanalysis और इमेजिंग के लिए एक संभावित शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है. बेशक, इस प्रोटोकॉल के सबसे जटिल भाग संरेखण और लेजर प्रणाली के तुल्यकालन है. जब खरोंच से शुरू करने, दालों के तुल्यकालन, यानी यह सुनिश्चित करना है कि दालों समय में अलग अलग रास्तों वे ले एक नाड़ी autocorrelator के उपयोग से मदद की जा सकती बावजूद छा जाता है. एक बार स्थानिक और लौकिक ओवरलैप हासिल है, कारों और DR-कारों के संकेतों को आसानी से detectable होना चाहिए. हालांकि, पहले संरेखण अक्सर, कच्चे तेल में कमजोर संकेतों में जिसके परिणामस्वरूप. इस प्रणाली अच्छी तरह से aligning के लिए सबसे अच्छा अभ्यास करने के लिए शुरू कमजोर संकेतों को उत्पन्न करने के लिए और फिर प्रत्येक मार्ग के किनारे धीरे दर्पण tweaking और लौकिक देरी चरणों का उपयोग ओवरलैप समायोजन द्वारा सिग्नल की शक्ति में सुधार है. हालांकि स्पेक्ट्रोमीटर / monochromator कृत्यों कमरे के प्रकाश के लिए एक बहुत ही कुशल भ्रमित के रूप में साफ परिणाम कमरे में रोशनी के साथ ऑपरेटिंग सिस्टम के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है बंद कर दिया और पर्दे या लेंस टयूबिंग विभिन्न अन्य प्रकाश स्रोतों (जैसे कंप्यूटर पर नज़र रखता है के द्वारा शुरू की पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, सूचक रोशनी, एल ई डी, आदि).

हमारे विशेष सेटअप एकल फोटॉन गिनती हिमस्खलन फोटो डायोड (APD) डिटेक्टरों और समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) का पता लगाने के लिए ⁵ हार्डवेयर का इस्तेमाल करता है. यह अपेक्षाकृत कम शोर है, लेकिन कई समूहों चर फायदेमंद लाभ जब समान माप बनाने के साथ फोटो गुणक ट्यूब (PMT) मिल गया है के साथ हमें बेहद कमजोर संकेतों का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है. PMT है के लाभ यह है कि वे चर लाभ प्रदान करते हैं और एक बहुत बड़ा का पता लगाने क्षेत्र है जो डिटेक्टर के संरेखण को सरल कर सकते है. इसके अतिरिक्त, हमारे सेटअप piezo चरणों का इस्तेमाल करने के लिए उद्देश्य अनुवाद के क्रम में बीम स्कैनिंग हासिल है. इस का लाभ यह है कि हम पहले से स्कैन की गई छवि के भीतर सटीकता की एक उच्च डिग्री के साथ किसी भी स्थान के लिए और वापस सहज रमन स्पेक्ट्रा सहित अतिरिक्त माप लेने की क्षमता है. अन्य समूहों सफल स्कैनिंग विधानसभाओं दर्पण, या यहाँ तक कि पूरे ओलिंप FluoView सिस्टम है, जो बहुत तेजी से इमेजिंग प्रदान करता है, लेकिन इसके ठीक एक छवि के भीतर मनमाना स्थानों पर लौटने की क्षमता में सीमित है जैसे confocal स्कैनिंग इकाइयों का उपयोग किया गया है.

ट्यूनिंग लेज़रों मैच रमन अनुनाद भी एक महत्वपूर्ण कदम है कि कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. हालांकि रमन चोटियों अधिकतम वर्णक्रमीय चोटी DR-कारों और कारों से प्राप्त तीव्रता जाना हो सकता है जरूरी सहज रमन चोटी के अधिकतम करने के लिए अनुरूप नहीं है. यह चार लहर एक गैर गुंजयमान पृष्ठभूमि सिगनल और कारों, जो कारों सहज रमन स्पेक्ट्रा रिश्तेदार स्पेक्ट्रा distorts अग्रणी मिश्रण द्वारा उत्पन्न संकेतों के आंतरिक हस्तक्षेप के कारण है. कारों संकेत के चोटी के वर्णक्रमीय स्थान, गणना की जा सकती है लेकिन एक और अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण रमन अनुनाद की उम्मीद स्थान भर में कई छोटे वर्णक्रमीय चरणों में OPOs धुन है. यह प्रक्रिया एक स्पष्ट अधिकतम उपज चाहिए. वास्तव में, दोनों अनुनादों DR-FWM से सबसे बड़ी संवेदनशीलता के लिए इस अधिकतम करने के लिए tuned किया जाना चाहिए.

एक दृष्टिकोण डॉ कारों – के अंतिम संभावित समस्या पर भी विचार – विमर्श हो गया है, यानी संकेत डॉ कारों रमन सक्रिय amplifying अणु के एक सजातीय वितरण पर निर्भर करेगा. सबसे जैविक वस्तुओं के लिए, यह अच्छी तरह से पानी से व्यापक OH प्रतिध्वनि है, जो प्रचुर मात्रा में है और लगभग सर्वव्यापी हो सकता है. जल है, तथापि, हाइड्रोफोबिक लिपिड बूंदों के रूप में एक सेल के साथ, क्षेत्रों, अग्रणी प्राप्त है जब पानी अनुनाद का उपयोग करने के लिए लिपिड मोड बढ़ाना संकेतों के एक विकृति से बाहर रखा गया है. हमारे उदाहरण में, हम deuterated ग्लूकोज के एक समाधान का इस्तेमाल किया है हमारे जैविक नमूने के लिए एक और आसानी से detectable और प्रचुर मात्रा में संकेत उत्पन्न. इसी तरह, पानी deuterated या जैविक buffe deuteratedरुपये, D-HEPES जैसे इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे उदाहरण में, सी. के भीतर लिपिड बूंदों एलिगेंस कीड़ा काफी छोटे हमेशा हमारे सिस्टम का ध्यान केंद्रित लेजर हाजिर के भीतर दोनों deuterated ग्लूकोज समाधान और lipids शामिल थे . तथापि, यह आमतौर पर सच नहीं है. एक विशिष्ट उदाहरण adipocytes, जो अपने भीतर cytoplasm बल्कि बड़ी लिपिड बूंदों उत्पन्न होगा. इसका मतलब है, किसी भी तकनीक डॉ कारों के साथ किए गए प्रयोग सावधान तैयारी और नियंत्रण प्रयोगों के परिणामों को सत्यापित करने की आवश्यकता है.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
60X water immersion objective		Olympus	UPLSAPO 60XW
Inverted Microscope		Olympus	IX-71SIF-3
Pockels Cell		ConOptics	350-160
Picotrain pump Laser		HighQ	IC-1064-10000
Optical Parametric Oscillator		APE	Levante IR
1.5 Glass cover slips		Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Half-wave plates		Thor Labs	AHWP05M-980
Polarizing Beam Splitter Cubes		Thor Labs	PBS052 or PBS053
Spectrometer/Monochromator		PI Acton	Spectra Pro 2300i
CCD Camera		PI Acton	PIXIS: 100B
Avalanche Photo Diode		Perkin Elmer	SPCM-AGR-14-12691
XYZ Piezo Stage		Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	This is a combination of an XY stage and a Z objective holder
Dichroic Mirrors		Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.
Dichroic Mirror		Chroma	Z830rdc	To combine the different near-infrared laser beams
TCSPC board		PicoQuant	Timeharp 200
Symphotime Imaging Software		PicoQuant
Matlab		Mathworks