Комбинация из трех одной длины волны короткие импульсные лазеры используется для генерации когерентного антистоксова рассеяния света (КАРС) и дважды резонансных CARS (DR-КАРС). Разница между этими сигналами обеспечивает повышенную чувствительность в противном случае трудно обнаружить когерентного комбинационного сигналы, что позволяет визуализации слабых комбинационного рассеивателями.
Когерентного комбинационного методов визуализации наблюдается резкое повышение активности за последнее десятилетие из-за их обещание включить без наклеек оптических изображений с высокой молекулярной специфичности 1. Чувствительность этих методов, однако, на много порядков слабее, чем флуоресценция, требующих милли-молярных молекулярной 1,2 концентрациях. Здесь мы описываем технику, которая может включить обнаружение слабых или низких концентрациях комбинационно-активных молекул путем усиления их сигнал с полученным от сильных или обильным комбинационного рассеивателями. Взаимодействия коротких импульсных лазеров в биологических пример приводит к возникновению различных когерентного комбинационного рассеяния сигналов, каждый из которых выполнять уникальную информацию о химических образца. Как правило, только один из этих сигналов, например когерентного антистоксова рассеяния света (КАРС), используется для создания изображения, а остальные отбрасываются. Однако, когда эти другие сигналы, в том числе 3-цветный АВТОМОБИЛИ и четыре смешения (ЧВС), собираются и по сравнению с КАРС-сигнала, в противном случае трудно обнаружить информацию можно извлечь 3. Например, дважды резонансных CARS (DR-КАРС) является результатом конструктивной интерференции между двумя резонансными сигналами 4. Мы показываем, как настройка трех лазеров, необходимых для производства DR-АВТОМОБИЛИ сигналов на 2845 см -1 CH растянуть вибрации в липиды и 2120 см -1 CD валентного колебания дейтерированных молекулы (например дейтерированных сахара, жирные кислоты и др.) могут быть использованы для исследования и комбинационного резонансов одновременно. В этих условиях, в дополнение к АВТОМОБИЛИ сигналы от каждого резонанса, комбинированные DR-КАРС-сигнала зондирования и также генерируется. Мы показываем, как обнаружить различия между DR-КАРС-сигнала и усиливает сигнал от вибрации обильные молекулы могут быть использованы для повышения чувствительности для слабого сигнала. Кроме того, мы показали, что этот подход распространяется даже для приложений, где оба сигнала создаются из различных молекул, таких, что например, с помощью сильного комбинационного сигнала растворителя может усилить слабый сигнал комбинационного разбавленный раствор.
Спектроскопии комбинационного рассеяния и комбинационного основе изображений являются мощными инструментами в новых био наук. В настоящее время это особенно верно для в естественных условиях и в пробирке изучение клеточного метаболизма и нарушения обмена веществ по переработке и хранению липидов. Большинство биологических макромолекул содержат большое количество подобных, в основном на основе углерода молекулярных связей, так что спектры комбинационного рассеяния получены из клеток и организмов, как правило, свертки взносов из липидов, белков, нуклеиновых кислот, сахара, липиды и т.д. могут быть сравнительно легко изолировать от этих сложных спектров, из-за их склонности к образованию плотных капель или бислоев и потому, что они содержат расширенные цепей с большим количеством облигаций алифатических СН. Наша способность изолировать специфические белки, аминокислоты, РНК или ДНК в комплексе клеточного окружения, однако, весьма ограничены. Это особенно верно, если эти молекулы представляют интерес только присутствовать на мкМ концентрации и ниже. Здесь, возможность проверки слабые комбинационного резонансов используя наши вновь вводимых DR-АВТОМОБИЛИ разница изображения техники обеспечивает потенциально мощный подход к их микроанализа химического и обработки изображений. По общему признанию, самым сложным часть этого протокола является выравнивание и синхронизацию лазерной системы. Начиная с нуля, синхронизации импульсов, то есть обеспечение того, чтобы импульсы накладываются друг на друга во времени, несмотря на разные пути они берут может быть облегчен за счет использования импульса автокоррелятора. Как только пространственные и временные перекрытия достигается, автомобили и DR-АВТОМОБИЛИ сигналы должны быть легко обнаружены. Тем не менее, первое выравнивание часто сырой, в результате слабых сигналов. Рекомендуется для выравнивания этой системы также является изначально генерировать слабые сигналы, а затем для улучшения сигнала, осторожно настройки зеркала вдоль каждого пути и корректировки временных перекрытия использованием задержки этапов. Хотя спектрометр / монохроматора действует как очень эффективный перегородка для комнаты светом чистым результатов можно добиться от операционной системы с комнате свет выключен и занавески или объектив трубы, чтобы минимизировать фон введены различные другие источники света (мониторы например, компьютер, индикаторы, светодиоды и др.).
Наша особая установка использует одного счета фотонов лавина фотодиод (APD) детекторов и с корреляцией по времени одного счета фотонов (TCSPC) аппаратные средства для обнаружения 5. Это позволяет обнаруживать чрезвычайно слабые сигналы с относительно низким уровнем шума, но многие группы нашли фото-умножители (ФЭУ в) с переменной получить выгодный при принятии подобных измерений. Преимущество PMT является то, что они предлагают переменную прибыль и имеют гораздо больший зоны обнаружения, которые могут упростить выравнивание детектора. Кроме того, в нашей установке используется пьезо этапах переводить цели для достижения луч сканирования. Преимуществом этого является то, что у нас есть возможность вернуться в любое место в пределах ранее отсканированное изображение с высокой степенью точности и принять дополнительные измерения, включая спектры СКР. Другие группы добились успеха использованием сканирующего зеркала собраний, или даже целые конфокальной единиц, таких как сканирование системы Olympus FluoView, который предлагает гораздо быстрее визуализация, но ограничен в своих возможностях, чтобы точно вернуться в произвольных местах в пределах изображения.
Настройка лазеров в соответствии с комбинационным резонансом также является важным шагом, который может потребовать некоторой оптимизации. Хотя комбинационного пики могут быть известны максимальной спектральной интенсивности пик, полученный от DR-автомобили и автомобили не обязательно соответствует максимуму СКР пика. Это связано с внутренним вмешательством сигналы, генерируемые четьрехволновые, ведущих к нерезонансный фоновый сигнал и легковых автомобилей, что искажает АВТОМОБИЛИ спектрах относительно спектров СКР. Спектральных расположение пика сигнала КАРС можно рассчитать, но более практичным подходом является мелодия ОПГ в нескольких, небольшие спектральные шаги по ожидаемом месте комбинационного резонанса. Этот процесс должен дать четкий максимум. В самом деле, для наибольшей чувствительностью от DR-ЧВС как резонансы должны быть настроены на этот максимум.
Последний потенциальные проблемы DR-АВТОМОБИЛИ подход должен также обсудить, т.е. DR-КАРС-сигнала будет зависеть от однородного распределения комбинационно-активной усиливающей молекулы. Для большинства биологических объектов, это может быть широкий резонанс ОН из воды, которая есть в изобилии и почти вездесущим. Вода, однако, исключены из гидрофобных регионов с клеток, например, липидные капли, что привело искажения сигналов, полученных при использовании воды для усиления резонанса липидного режимах. В нашем примере мы использовали решение дейтерированных глюкозы для получения легко обнаружить и обильные сигнал для нашего биологического образца. Кроме того, дейтерированных воды или дейтерированных биологических buffeRS, такие, как г-HEPES могут быть использованы. В нашем примере, липидные капли в C. Элеганс червя были достаточно малы, чтобы всегда содержать как, дейтерированных раствора глюкозы и липидов в сфокусированного лазерного пятна нашей системе. Это, однако, вообще говоря, неверно. Конкретный пример будет адипоцитов, которые генерируют достаточно большие капли липидного в их цитоплазме. Это означает, что любой эксперимент, проведенный с DR-АВТО техника требует тщательной подготовки и контрольные эксперименты для проверки результатов.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Ивана Schie и Себастьян Wachsmann-Hogiu за их вклад в развитие DR-АВТОМОБИЛИ техники. Тайлер недели признает поддержке Программы Лоуренс ученый из Ливерморской национальной лаборатории. Томас Huser выражает благодарность за поддержку со стороны Американской ассоциации сердца через Грант-в-помощь программы. Эта работа также была частично поддержана финансирование от Национального научного фонда. Центр биофотоники, NSF научно-технический центр, находится в ведении Университета Калифорнии в Дэвисе, под соглашением о сотрудничестве номер 0120999 PHY. Поддержка также признал от UCD Клинические Поступательное Научного центра по гранту Число UL1 RR024146 из Национального центра по ресурсам исследований (NCRR).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |