Мы демонстрируем протокол для аксоплазме изоляции от взрослой крысы седалищного нерва на основе рассечение нервных пучков и инкубации в гипотонической среде, чтобы освободить миелина и лизировать не-аксонального структур с последующим извлечением оставшейся аксон обогащенного материала.
Abstract
Выделение чистой аксонального цитоплазмы (аксоплазме) из периферических нервов имеет решающее значение для биохимических исследований многих биологических процессов. В этой статье мы покажем и описать протокол для аксоплазме изоляции от взрослой крысы седалищного нерва основано на следующие этапы: (1) рассечение нервных пучков и разделения соединительной ткани; (2) инкубация коротких сегментов нервных пучков в гипотонической среде освободить миелина и лизировать не-аксонального структур, а также (3) извлечение из оставшихся аксон обогащенного материала. Протеомных и биохимические характеристики этого препарата подтвердили высокую степень обогащения аксонального компонентов.
Protocol
Этот протокол позволяет аксоплазме изоляция с минимизацией глиальных и сосудистых тканей загрязнения. Метод дает примерно 70-100 мкг общего белка аксоплазме на одну неделю 8-10 старых крыс линии Вистар. 1. Рассеките седалищного нерва Усыпить двух крыс СО 2 ингаля…
Discussion
Биохимические и протеомных анализов подтвердили, что эта процедура сокращает сыворотку и глиальных клеток загрязнения 3 по сравнению с ранее описанных методов аксоплазме изоляции механического сжатия 1. Мы использовали этот протокол аксоплазме изоляции для изучения дине?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
Male Wistar rats (8-10 weeks old)
PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml
Eppendorfs for 1.5 ml
Sterilized plastic dishes 35 mm
Dissecting tools including: scissors and fine forceps
Binocular and table light
Antibodies
Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).
Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axoplasm isolation from peripheral nerve.Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).