Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten
Summary
Dieses Protokoll umfasst eine nicht-radioaktive<em> In-situ</em> Hybridisierungsverfahren, dass die gleichzeitige Identifizierung von zwei Transkript Spezies ermöglicht, bei einer einzigen Zelle Auflösung, in dünne Schnitte von Gehirn der Wirbeltiere.
Abstract
Hier beschreiben wir eine modifizierte Version des Doppel-Fluoreszenz-<em> In situ</em> Hybridisierung (dFISH)-Methode für Nachweis von zwei mRNAs von Interesse in Frischplasma Hirnschnitten optimiert. Unsere Gruppe hat erfolgreich dieser Ansatz verwendet, um Gen-Co-Regulierung zu studieren. Genauer gesagt, haben wir diese dFISH Methode verwendet, um die anatomische Organisation, neurochemischen Eigenschaften und die Auswirkungen der sinnlichen Erfahrung in zentralen sensorischen Schaltungen zu erkunden, um einzelne Zelle Auflösung. Dieses Protokoll wurde im Hirngewebe von Mäusen, Ratten und Singvögel validiert wird aber erwartet, dass sie leicht an andere Wirbeltierarten, sowie zu einer Reihe von nicht-neuronalen Gewebe. In diesem Film stellen wir eine detaillierte Demonstration der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens.
Protocol
Discussion
Wir haben dieses Protokoll verwendet, um zu untersuchen, wie Gehirn der Wirbeltiere neurochemisch und funktional organisiert ist, und um festzustellen, wie verhaltensgestörte relevanten sensorischen Reizen Auswirkungen der genomischen Maschinerie der Nervenzellen im erwachsenen Gehirn 8-10. Wir haben erfolgreich diese Methode in Hirngewebe von Mäusen, Ratten und Singvögel, aber erwarten, dass dieses Protokoll wird einfach an Hirnschnitten aus einem Array von Wirbeltierarten und, vielleicht, nicht-neuralen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeit unterstützt durch Zuschüsse der NIH / NIDCD und der Schmitt-Stiftung zur RP.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
| PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
| Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
| Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
| Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
| DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
| Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
| RNasin | Promega | N2111 | ||
| BSA | Sigma | 05491 | ||
| DTT | Sigma | D5545 | ||
| Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
| EDTA | VWR | 101384-758 | ||
| SDS | Sigma | L4390 | ||
| Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
| 10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
| Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
| NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
| Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
| Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
| SSPE | VWR | 82021-488 | ||
| Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
| Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
| Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
| Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
| Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
| Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
| Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
| TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
| TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
| Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
| Vectashield | Vector | H-1000 | ||
| embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
| cryostat | Leica | CM 1850 | ||
| Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
Solutions
- Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
- Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
- TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
- TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
- TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
- Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
- Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.
Referências
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