Após a exposição de antígenos, subpopulações de células ativadas B passam por um processo conhecido como recombinação mudança de classe (CSR) para produzir isotipos de anticorpos com diferentes funções efetoras. O protocolo apresentado neste relatório explica como a RSE pode ser induzido e analisados In vitro Para efeitos de estudo B a função celular.
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Artigo de método
Indução e Avaliação de recombinação mudança de classe em purificada Células B murino
Neste artigo
Resumo
Resumo
Imunidade humoral é o ramo do sistema imunológico mantido por células B e mediada através da secreção de anticorpos. Após a ativação de células B, o locus da imunoglobulina sofre uma série de modificações genéticas para alterar a capacidade de ligação e função efetora de anticorpos secretados. Este processo é destacado por um evento de recombinação do genoma conhecido como recombinação classe switch (CSR), no qual o padrão isotipo de anticorpos IgM é substituído por um de IgG, IgA ou IgE. Cada isotipo possui diferentes funções efetoras tornando CSR crucial para a manutenção da imunidade.
Diversificação do lócus imunoglobulina é mediada pela enzima citidina desaminase ativação induzida (AID). Um vídeo esquemáticos descrevendo esse processo em detalhes está disponível online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Atividade da AID e na via de RSE são comumente estudados na avaliação da função das células B e imunidade humoral em camundongos. O protocolo apresentado neste relatório apresenta um método de isolamento de células B do baço de camundongos e estimulação subseqüente com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) para induzir a mudança para classe IgG3 (para isotipos outro anticorpo ver Tabela 1). Além disso, a coloração fluorescente de células corante carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) é usado para monitorar a divisão celular de células estimuladas, um processo crucial para a mudança isotipo 1, 2.
A regulamentação da AID e do mecanismo pelo qual ocorre RSE ainda não estão claros e, portanto, em ensaios in vitro interruptor classe fornecem um método confiável para testar esses processos em vários modelos de mouse. Estes testes têm sido utilizados anteriormente no contexto da deficiência do gene usando camundongos knockout 3. Além disso, in vitro comutação de células B pode ser precedida por transdução viral para modular a expressão gênica por RNA knockdown ou expressão do transgene 4-6. Os dados desses tipos de experimentos têm impactado a nossa compreensão da atividade AID, a resolução da reação de RSE, e mediada por anticorpos de imunidade no mouse.
Protocolo
Etapa I: Isolamento de células B do baço via de enriquecimento magnética
- Camundongos experimentais devem ser envelhecidos 8-12 semanas para garantir a plena maturação do sistema imunológico.
- Euthanize o mouse por deslocamento cervical e mergulhar em etanol 70%. Remoção cirúrgica do baço por fazer uma incisão através da pele e do músculo do hipocôndrio esquerdo do abdômen e corte-o em três pedaços grandes em tampão fosfato salino (PBS). Assegurar que todas as ferramentas e os reagentes são estéreis.
- Usando o final de borracha de uma seringa de 1 mL êmbolo, gentilmente amasse o baço através de um filtro de células 70 mM em PBS. Certifique....
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Discussão
O protocolo descrito acima fornece um ensaio padrão para analisar a expressão de AID e função durante a mudança de classe de células primárias de B murinos. Este protocolo usa LPS bacteriano para induzir a mudança de IgM para IgG3, apesar de modificações para a mídia estimulação pode ser feita para induzir a mudança para outros isotipos (resumidos na Tabela 1 8, 9).
Temos notado que, por razões ainda desconhecidas, soro fetal bovino pode afetar o nível de classe de comutação obser.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Somos gratos ao laboratório Martin para discussões úteis. Esta publicação é apoiada por uma bolsa do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (MOP-89783). AM é apoiado por um presidente de Pesquisa do Canadá Nível II Prêmio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução Salina Tamponada com Fosfato | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Kit de Enriquecimento de Células B de Camundongo EasySep | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Tubos de Poliestireno | BD Biosciences | 352058 | |
| Albumina Sérica Bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Kit de Proliferação Celular CellTrace CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| Soro de Bezerro Bovino | Hyclone | SH30072.03 | |
| Meio de Cultura RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolissacarídeos de Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapto–etanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Soro Fetal Bovino | Hyclone | SH30396.03 | |
| Soro de Camundongo Normal | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Rato Purificado Anti-Mouse CD16/CD32 (Bloqueador de Fc da BD para Camundongo) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anticorpo Rato Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
Referências
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are....
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Reimpressões e permissões
