प्रेरण और murine बी कक्ष शुद्ध में कक्षा स्विच पुनर्संयोजन के मूल्यांकन
Summary
प्रतिजन जोखिम के बाद, सक्रिय बी कोशिकाओं के उप – जनसंख्या एक वर्ग स्विच पुनर्संयोजन (सीएसआर) के रूप में जाना जाता है के लिए विशिष्ट effector कार्यों के साथ एंटीबॉडी isotypes का उत्पादन प्रक्रिया से गुजरना. इस रिपोर्ट में उल्लिखित प्रोटोकॉल बताते हैं कि कैसे सीएसआर और प्रेरित किया जा सकता है विश्लेषण<em> इन विट्रो में</em> बी सेल समारोह अध्ययन के प्रयोजनों के लिए.
Abstract
Humoral रोगक्षमता बी कोशिकाओं द्वारा बनाए रखा है और एंटीबॉडी के स्राव के माध्यम से मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रणाली की शाखा है. बी सेल सक्रियण पर, immunoglobulin ठिकाना बाध्यकारी क्षमता और secreted एंटीबॉडी के effector समारोह में परिवर्तन करने के लिए आनुवंशिक संशोधनों की एक श्रृंखला आए. यह प्रक्रिया एक जीनोमिक पुनर्संयोजन वर्ग स्विच (सीएसआर) पुनर्संयोजन जिसमें डिफ़ॉल्ट आईजीएम एंटीबॉडी निर्धारण आईजीजी, IgA, या IgE के लिए एवजी है के रूप में जाना जाता घटना से प्रकाश डाला है. प्रत्येक निर्धारण अलग effector जिससे सीएसआर उन्मुक्ति के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण बनाने के कार्यों के पास.
Immunoglobulin बिन्दुपथ के विविधीकरण एंजाइम सक्रियण प्रेरित cytidine deaminase (सहायता) द्वारा मध्यस्थता है. विस्तार से इस प्रक्रिया का वर्णन एक योजनाबद्ध वीडियो उपलब्ध ऑनलाइन (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html) है. सहायता की गतिविधि और सीएसआर मार्ग आमतौर पर बी सेल समारोह और चूहों में humoral रोगक्षमता के मूल्यांकन में अध्ययन कर रहे हैं. इस रिपोर्ट में उल्लिखित प्रोटोकॉल murine spleens और जीवाणु (LPS) lipopolysaccharide वर्ग IgG3 करने के लिए स्विचन (अन्य एंटीबॉडी isotypes के लिए एक टेबल देखें) प्रेरित के साथ बाद में उत्तेजना से बी सेल अलगाव की एक विधि प्रस्तुत करता है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट सेल धुंधला डाई Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) प्रेरित कोशिकाओं के कोशिका विभाजन, एक करने के लिए स्विचन 1, 2 निर्धारण महत्वपूर्ण प्रक्रिया की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है.
सहायता के नियमन और व्यवस्था है जिसके द्वारा सीएसआर होता है अभी भी स्पष्ट नहीं है और इस प्रकार इन विट्रो वर्ग स्विच assays में विभिन्न माउस मॉडल में इन प्रक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करते हैं. ये assays के पहले जीन का उपयोग कर पीटा 3 चूहों की कमी के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया है . इसके अलावा, इन विट्रो बी कोशिकाओं की स्विचन में वायरल पारगमन द्वारा पहले किया जा सकता है आरएनए पछाड़ना या transgene अभिव्यक्ति 4-6 से जीन अभिव्यक्ति न्यूनाधिक . प्रयोगों के इन प्रकार से डेटा सहायता गतिविधि, सीएसआर प्रतिक्रिया का संकल्प, और माउस में प्रतिरक्षा एंटीबॉडी की मध्यस्थता की हमारी समझ को प्रभावित किया है.
Protocol
Discussion
ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल के लिए एक मानक प्राथमिक murine बी कोशिकाओं के वर्ग स्विचन के दौरान सहायता अभिव्यक्ति और समारोह का विश्लेषण परख प्रदान करता है. यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियल LPS का उपयोग करता है आईजीएम से Ig…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपयोगी विचार – विमर्श के लिए मार्टिन प्रयोगशाला के लिए आभारी हैं. इस प्रकाशन में कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (एमओपी 89,783) से एक अनुदान द्वारा समर्थित है. AM कनाडा अनुसंधान चेयर टियर द्वितीय पुरस्कार द्वारा समर्थित है.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
Referências
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
