Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가
Summary
항원 노출에 따라 활성화된 B 세포의 subpopulations는 독특한 효과기 기능 항체 isotypes를 만들어 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 공정을 받고있다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 CSR을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다<em> 체외에서</em> B 세포 기능을 공부 목적.
Abstract
체액성 면역은 B 세포에 의해 유지 및 항체의 분비를 통해 중재 면역 시스템의 지점이다. B 세포 활성화되면 면역 글로불린 로커스는 바인딩 용량과 분비 항체의 이펙터 기능을 변경하는 유전자 수정 일련의를 겪습. 이 프로세스는 기본 IgM 항체의 isotype은 IgG, 이가, 또는 IGE 중 하나에 대체되는 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 게놈 재조합 이벤트로 강조 표시됩니다. 각 isotype되므로 면역의 유지 관리 CSR은 중요하고 독특한 이펙터 기능을 가지고 있습니다.
면역 글로불린 로커스의 다변화는 효소 활성 유발 cytidine deaminase의 (AID)에 의해 중재됩니다. 자세히이 과정을 설명하는 도식 동영상은 온라인 (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html)입니다. AID의 활동 및 CSR의 경로는 일반적으로 B 세포 기능과 마우스의 체액성 면역의 평가에서 공부하고 있습니다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 murine spleens와 클래스 (다른 항체 isotypes에 대한 표 1 참조) IgG3로 전환 유발하는 박테리아 lipopolysaccharide (LPS)와 후속 자극에서 B 세포 분리의 방법을 보여줍니다. 또한, 형광 세포 염색 얼룩 Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)를 자극 세포의 세포 분열, 스위칭 1, 2 isotype에 중요한 프로세스를 모니터하는 데 사용됩니다.
구호품과 CSR이 발생하는 메커니즘의 규정은 아직 불분명하고 있으므로 체외 클래스 스위치 assays 다양한 마우스 모델에서 이러한 프로세스를 테스트하기위한 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이러한 assays는 이전에 다음 ID로 녹아웃 마우스 3를 사용하여 유전자 결핍의 맥락에서 사용되었습니다. 또한, 관내는 B 세포의 스위칭 RNA의 분해 또는 transgene 표현 4-6에 의해 유전자 발현을 조절하는 바이러스 전달 앞에 수 있습니다. 실험 이러한 종류의 데이터는 구호 활동, CSR 반응의 해상도 및 마우스에서 항체 – 매개 면역에 대한 우리의 이해에 영향을합니다.
Protocol
Discussion
위에서 설명한 프로토콜은 기본 murine B 세포의 클래스 스위칭하는 동안 보조 표현과 기능을 분석하기위한 표준 분석을 제공합니다. 자극 미디어에 수정이 다른 isotypes (표 1 8, 9에 요약)으로 전환 유도하기 위해 만들 수 있지만이 프로토콜은, IgM에서 IgG3로 전환 유발하는 박테리아 LPS를 사용합니다.
우리는 아직 알려지지 않은 이유로, 태아 송아지 혈청 클래스 체외에?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 토론에 대한 마틴의 실험실에 감사하고 있습니다. 이 책자는 건강 연구의 캐나다 연구소 (걸레 – 89783)에서 부여로 지원됩니다. AM은 캐나다 연구 의자 티어 II 수상에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
Referências
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
