We introduceren een snelle fluorescentie-gebaseerde test die de mate van fluorescentie quenching als een maat voor gramicidine kanaal activiteit monitoren. De gramicidine kanalen worden gebruikt als moleculaire krachtopnemers op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten controleren.
Veel geneesmiddelen en andere kleine moleculen die gebruikt worden voor het moduleren van biologische functie zijn amfifielen dat adsorberen aan de bilaag / oplossing interface en daardoor lipide bilaag eigenschappen te veranderen. Dit is belangrijk omdat membraaneiwitten zijn energetisch gekoppeld aan hun gastheer bilaag door hydrofobe interacties. Veranderingen in de bilaag eigenschappen zo te veranderen membraaneiwit functie, die een indirecte manier voor amfifielen te moduleren eiwit functie en een mogelijk mechanisme voor de "off-target" drug effecten biedt. We hebben eerder ontwikkelde een elektrofysiologische test voor het detecteren van veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen met behulp van lineaire gramicidine kanalen als probes 3,12. Gramicidine kanalen zijn mini-eiwitten gevormd door de transbilayer dimerisatie van twee niet-geleidende subunits. Ze zijn gevoelig voor veranderingen in hun membraan omgeving, waardoor ze krachtig probes voor het monitoren van veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten. We hebben nu laten zien een fluorescentie assay voor het detecteren van veranderingen in de bilaag eigenschappen met behulp van dezelfde kanalen als probes. De test is gebaseerd op het meten van het tijdsverloop van de fluorescentie quenching van de fluorofoor-loaded grote unilamellaire blaasjes te wijten aan het binnendringen van een quencher via de gramicidine kanalen. We gebruiken de fluorescentie-indicator / quencher paar 8-Aminonaftaleen-1 ,3,6-trisulfonate (mieren) / Tl + die met succes is gebruikt in andere fluorescentie quenching assays 5,13. Tl + doordringt de lipide bilaag langzaam acht, maar passeert gemakkelijk door het uitvoeren van gramicidine kanalen 1,14. De methode is schaalbaar en geschikt voor zowel mechanistische studies en high-throughput screening van kleine moleculen voor bilaag-storende, en potentiële "off-target ', effecten. We vinden dat de resultaten met deze methode zijn in goede overeenstemming met eerdere elektrofysiologische resultaten 12.
We hebben aangetoond dat een snelle fluorescentie-gebaseerde test voor het bepalen van de bilaag wijzigen potentieel van drugs en andere kleine amfifielen. Verbindingen die bilaag eigenschappen te wijzigen zijn waarschijnlijk membraan eiwitten functioneren in een indirecte, niet-specifieke manier te veranderen, eventueel bij te dragen aan "off-target" drug-effecten. De test maakt gebruik van de kracht van gramicidine kanalen als probes voor de veranderingen in de bilaag eigenschappen van 12 die word…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Michael J. Bruno, Radda Rusinova en Jon T. Sack voor vele stimulerende discussies. De financiële steun van NIH, R01GM021342 en ARRA vullen R01GM021342-35S1 en de Josia Macy, Jr Stichting OSA, de Tri-I CMB programma voor HII, en de Iris L. en S. Woodworth Leverett Medical Fellowship Scientist en NIH MSTP verlenen GM07739 voor RK.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |