Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים
Summary
אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.
Abstract
תרופות רבות מולקולות קטנות אחרות נהגו לווסת את הפונקציה הביולוגית הם amphiphiles כי לספוג בממשק bilayer / הפתרון ובכך לשנות את מאפייני bilayer השומנים. זה חשוב כי חלבונים בממברנה הם מצמידים במרץ bilayer המארח שלהם על ידי אינטראקציות הידרופוביות. שינויים במאפייני bilayer ובכך לשנות את חלבון קרום פונקציה, אשר מספק דרך עקיפה amphiphiles לווסת את תפקוד החלבון ומנגנון אפשרי "מחוץ היעד" השפעות התרופה. פיתחנו בעבר assay אלקטרו לאיתור שינויים במאפייני bilayer השומנים באמצעות ערוצים gramicidin ליניארי כמו בדיקות 3,12. ערוצי Gramicidin הם מיני חלבונים שהוקמה על ידי dimerization transbilayer של שתי יחידות משנה שאינם מנהלים. הם רגישים לשינויים בסביבה הממברנה שלהם, מה שהופך אותם בדיקות עוצמה עבור ניטור שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש. אנחנו עכשיו להפגין assay הקרינה לאיתור שינויים במאפייני bilayer באמצעות אותם ערוצי בדיקות. Assay מבוססת על מדידת זמן מהלך מרווה פלואורסצנציה מ fluorophore טעון שלפוחית unilamellar גדול בשל כניסתם של מרווה בצינורות gramicidin. אנו משתמשים זוג הקרינה אינדיקטור / מרווה 8-aminonaphthalene-1-,3,6 trisulfonate (נמלים) / טי + כי שימש בהצלחה אחרות מבחני מרווה פלואורסצנציה 5,13. טי + מחלחלת לאט bilayer השומנים 8 אך עובר בקלות דרך מנהל ערוצי gramicidin 1,14. השיטה היא מדרגי מתאים גם מחקרים מכניסטית תפוקה גבוהה ההקרנה של מולקולות קטנות עבור מביך-bilayer, ואת הפוטנציאל "מחוץ היעד", אפקטים. אנו מוצאים כי התוצאות בשיטה זו הן בהסכם טוב עם תוצאות אלקטרו הקודם 12.
Protocol
Discussion
יש לנו הפגינו assay מהיר הקרינה מבוססי לקביעת פוטנציאל bilayer שינוי של תרופות amphiphiles קטנים אחרים. תרכובות לשנות את מאפייני bilayer צפויים לשנות חלבון קרום לתפקד באופן עקיף, ספציפי, אולי תורם "מחוץ היעד" השפעות התרופה. Assay מנצל את כוחו של ערוצי gramicidin כמו בדיקות לשינויים המ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מייקל ג'יי ברונו, Radda Rusinova וג'ון ט שק לדיונים מגרה רבים. תמיכה כספית מ-NIH, R01GM021342 ואת ערה תוספת R01GM021342-35S1, ואת מייסי ג'וניור יאשיהו קרן אל OSA, Tri-אני תוכנית קרינת הרקע הקוסמית עבור HII; ו ל איריס לוורט ס וודוורת רפואי המדען אחוות ו-NIH MSTP מענק GM07739 עבור ר.ק..
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
| gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
| PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |
Referências
- Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. Ion transport through simple membranes. Renal Function. , (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. Gramicidin channels. Versatile tools. Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).
- Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential. Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).
- Bruggemann, E. P., Kayalar, C. Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).
- Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).
- Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange. Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).
- Gutknecht, J. Cadmium & thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).
- Ingólfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Curcumin is a modulator of bilayer material properties. Bioquímica. 46, 10384-10391 (2007).
- Keserü, G. M., Makara, G. M. The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).
- Leeson, P. D., Springthorpe, B. The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry. Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).
- Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).
- Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).
- Neher, E. Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion. Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).
- O’Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association. Science. 250, 1256-1259 (1990).
- Søgaard, R. GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity. Bioquímica. 45, 13118-13129 (2006).
- Waring, M. J. Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).
