그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정
Summary
우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.
Abstract
생물 학적 기능을 조절하는 데 사용되는 많은 약물 및 다른 작은 분자는 이중층 / 솔루션 인터페이스에서, 따라서 adsorb은 지질 이중층의 속성을 변경되는 amphiphiles 있습니다. 막 단백질은 소수성 상호 작용을 정력적으로 자신의 호스트 이중층에 결합되기 때문에 이것은 중요합니다. 이중층 등록 정보에 변경 따라서 단백질 기능 및 "오프 대상"약물 효과에 대한 가능한 메커니즘을 조절하는 amphiphiles에 대한 간접적인 방법을 제공 막 단백질 기능을 변경할 수 있습니다. 우리는 이전에 프로브 3,12과 같은 선형 그램이시딘 채널을 사용하여 지질 이중층 등록 정보에서 변경을 검출 electrophysiological 분석을 개발했습니다. 그램이시딘 채널은 두 아닌 수행 subunits의 transbilayer dimerization에 의해 형성 미니 단백질입니다. 그들은 지질 이중층 등록 정보 모니터링 변화를위한 강력한 프로브과 같이 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지하게 자신의 멤브레인 환경의 변화에 민감합니다. 우리는 지금 프로브와 같은 채널을 사용하여 이중층 속성의 변화를 검출 형광 분석을 보여줍니다. 분석은 그램이시딘 채널을 통해 끄는의 항목으로 인해 형광단 – 로드된 대형 unilamellar vesicles에서 형광의 담금질의 시간 코스를 측정을 기반으로합니다. 우리는 형광 표시 / 빛 따위를 끄는 쌍을 사용하여 8 aminonaphthalene – 1 ,3,6 – trisulfonate (개미) / TL + 성공적으로 다른 형광 담금질의 assays 5,13에서 사용되었는지. TL + 천천히 8 지질 이중층을 permeates하지만 그램이시딘 채널 1,14를 실시를 통해 쉽게 전달합니다. 방법은 기계론의 연구와 이중층 – perturbing하고, 잠재적인 "오프 대상"효과에 대한 작은 분자의 높은 처리량 검사를 모두 확장하고 적합합니다. 우리는이 방법을 사용하여 결과를 이전 electrophysiological 결과 12 좋은 계약에다는 것을 찾을 수 있습니다.
Protocol
Discussion
우리는 마약과 기타 소형 amphiphiles의 이중층 수정 가능성을 판단하는 빠른 형광 기반의 분석을 증명하고있다. 이중층의 속성을 수정 화합물 가능성이 "오프 대상"약물 효과에 기여, 간접, 특이 현상이 방식으로 막 단백질 기능을 변경할 수있다. 분석은 이중층 – 스패닝 단백질에 의해 감지 아르 이중층 등록 정보의 변경 12 프로브로 그램이시딘 채널의 전원을 이용. 형광 기반의 분?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 많은 자극 토론 마이클 J. 브루노, Radda Rusinova와 존 T. 색 감사합니다. NIH, R01GM021342와 아라 보완 R01GM021342 – 35S1, 그리고 OSA에 요시야 메이시, 주니어 재단에서 재정 지원, 트라이 – I HII위한 CMB 프로그램, 그리고 아이리스 L. 및 리버렛 S. 워스 의료 과학 원정대와 NIH MSTP 부여 RK위한 GM07739.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
| gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
| PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |
Referências
- Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. Ion transport through simple membranes. Renal Function. , (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. Gramicidin channels. Versatile tools. Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).
- Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential. Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).
- Bruggemann, E. P., Kayalar, C. Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).
- Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).
- Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange. Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).
- Gutknecht, J. Cadmium & thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).
- Ingólfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Curcumin is a modulator of bilayer material properties. Bioquímica. 46, 10384-10391 (2007).
- Keserü, G. M., Makara, G. M. The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).
- Leeson, P. D., Springthorpe, B. The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry. Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).
- Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).
- Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).
- Neher, E. Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion. Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).
- O’Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association. Science. 250, 1256-1259 (1990).
- Søgaard, R. GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity. Bioquímica. 45, 13118-13129 (2006).
- Waring, M. J. Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).
