Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme
Summary
Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.
Abstract
Biyolojik bir işlevi modüle etmek için kullanılan birçok ilaç ve diğer küçük moleküller bilayeri / çözüm arayüzü ve böylece adsorbe çift katlı lipid özelliklerini değiştirebilir amfifiler. Membran proteinlerin hidrofobik etkileşimler enerjik ev sahibi bilayeri birleştiğinde, çünkü bu önemlidir. Çift katlı özelliklerinde değişiklikler dolayısıyla protein fonksiyonu ve "off-hedef" ilaç etkileri için olası bir mekanizma modüle amfifiler için dolaylı bir yol sağlar membran protein fonksiyonu, değiştirirler. Daha önce 3,12 probları gibi lineer gramicidin kanallarını kullanarak, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri saptamak için bir elektrofizyolojik tahlil geliştirdik . Gramicidin kanalları transbilayer dimerization iletken olmayan iki alt birimden oluşan mini-proteinleri. Onlar, çift katlı lipid özellikleri izleme değişiklikler için güçlü probları bilayeri kapsayan proteinler tarafından algılanan yapar membran çevre, değişimlere duyarlıdır. Şimdi probları aynı kanallarını kullanarak çift katlı özelliklerinde değişiklik tespit için bir floresan tahlil göstermektedir. Tahlil gramicidin kanallar aracılığıyla quencher giriş nedeniyle fluorofor yüklü büyük unilamellar veziküller floresan su verme zamanı ders ölçme dayanmaktadır. Biz floresan göstergesi / söndürücü çifti 8-aminonaphthalene-1 ,3,6-trisulfonate (KARINCALARIN) / Tl + diğer floresan su verme deneyleri 5,13 başarıyla kullanılmaktadır. Tl + yavaş yavaş 8 çift katlı lipid nüfuz ama gramicidin kanallar 1,14 yürütülmesi yoluyla kolayca geçer. Bu yöntem, mekanistik çalışmalar ve bilayeri rahatsızlık vermesini, ve potansiyel "off-hedef", efektler için küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için ölçeklenebilir ve uygun. Biz bu yöntemi kullanarak sonuçları önceki elektrofizyolojik sonuçları 12 ile iyi bir anlaşma olduğunu bulabilirsiniz.
Protocol
Discussion
Biz, ilaç ve diğer küçük amfifiler bilayeri değiştirme potansiyeli belirlemek için hızlı bir floresan bazlı analiz göstermiştir. Bilayeri özelliklerini değiştirmek Bileşikler nonspesifik dolaylı bir şekilde membran protein işlevini değiştirmek için, muhtemelen "off-hedef" ilaç etkileri katkıda muhtemeldir. Bilayeri kapsayan proteinler tarafından algılanan çift katlı özelliklerinde değişiklik 12 probları olarak tahlil gramicidin kanalları güç patlatır. Floresans t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michael J. Bruno, Chianti Rusinova ve Jon T. Çuval birçok uyarıcı tartışmalar için teşekkür ederiz. NIH, R01GM021342 ve arra eki R01GM021342-35S1, ve OSA Josiah Macy, Jr. Vakfı'nın maddi destek; Üç HII için SPK programı ve Iris L. ve S. Leverett Woodworth Tıp Bilim Adamı Bursu ve NIH MSTP hibe RK için GM07739.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
| gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
| PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |
Referências
- Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. Ion transport through simple membranes. Renal Function. , (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. Gramicidin channels. Versatile tools. Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).
- Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential. Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).
- Bruggemann, E. P., Kayalar, C. Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).
- Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).
- Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange. Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).
- Gutknecht, J. Cadmium & thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).
- Ingólfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Curcumin is a modulator of bilayer material properties. Bioquímica. 46, 10384-10391 (2007).
- Keserü, G. M., Makara, G. M. The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).
- Leeson, P. D., Springthorpe, B. The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry. Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).
- Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).
- Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).
- Neher, E. Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion. Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).
- O’Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association. Science. 250, 1256-1259 (1990).
- Søgaard, R. GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity. Bioquímica. 45, 13118-13129 (2006).
- Waring, M. J. Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).
