Gramicidin-baserade Fluorescens-analys, för fastställande av små molekyler Potential för modifiering av membranet Egenskaper
Summary
Vi inför en snabb fluorescens-baserad analys som övervakar graden av fluorescens släcka som ett mått på gramicidin kanal aktivitet. Den gramicidin kanaler används som molekylära kraftgivare att övervaka förändringar i membranet egenskaper som kände av tvåskiktsmembran spänner proteiner.
Abstract
Många läkemedel och andra små molekyler som används för att modulera biologiska funktionen är biomolekylära som absorberar vid tvåskiktsmembran / lösningen gränssnitt och därmed ändra egenskaperna membranet. Detta är viktigt eftersom membranproteiner är energiskt kopplade till sin värd tvåskiktsmembran med hydrofoba interaktioner. Förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter förändrar därmed funktionen membran protein, som ger ett indirekt sätt för biomolekylära att modulera proteiners funktion och en möjlig mekanism för "off-target" läkemedelseffekter. Vi har tidigare utvecklat en elektrofysiologisk test för att upptäcka förändringar i membranet egenskaper med hjälp av linjär gramicidin kanaler som sonder 3,12. Gramicidin kanaler mini-proteiner som bildas av transbilayer dimerization av två icke-ledande subenheter. De är känsliga för förändringar i deras membran miljö, vilket gör dem kraftfulla sonder för övervakning av förändringar i fastigheter membranet som kände av tvåskiktsmembran spänner proteiner. Vi visar nu en fluorescens-test för att upptäcka förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter med samma kanaler som sonder. Analysen är baserad på mätning av tid loppet av fluorescens släcka från fluoroforen-loaded stora unilamellar blåsor på grund av införandet av en törstsläckare genom gramicidin kanaler. Vi använder fluorescerande indikator / quencher par 8-Aminonaftalen-1 ,3,6-trisulfonate (myror) / TL + som framgångsrikt har använts i andra fluorescens släcka analyser 5,13. Tl + genomsyrar membranet sakta 8, men går lätt föra en gramicidin kanaler 1,14. Metoden är skalbar och passar både mekanistiska studier och high-throughput screening av små molekyler för tvåskiktsmembran-störande, och möjligheter "off-target", effekter. Vi finner att resultat med denna metod är väl överens med tidigare elektrofysiologiska resultat 12.
Protocol
Discussion
Vi har visat en snabb fluorescens-baserad analys för fastställande av tvåskiktsmembran ändra potentialen av droger och andra små biomolekylära. Föreningar som modifierar tvåskiktsmembran egenskaper sannolikt att ändra funktion membranprotein på ett indirekt, ospecifik sätt kan bidra till en "off-target" läkemedelseffekter. Analysen utnyttjar kraften i gramicidin kanaler som sonder för förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter 12 som kände av tvåskiktsmembran-spänner proteiner. D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Michael J. Bruno, Radda Rusinova och Jon T. Sack för många stimulerande diskussioner. Ekonomiskt stöd från NIH, R01GM021342 och Arra komplettera R01GM021342-35S1, och Josiah Macy, Jr Foundation att OSA, Tri-Jag CMB program för HII och Iris L. och Leverett S. Woodworth Medicinsk Forskare Gemenskap och NIH MSTP bevilja GM07739 för RK.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
| gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
| PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |
Referências
- Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. Ion transport through simple membranes. Renal Function. , (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. Gramicidin channels. Versatile tools. Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).
- Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential. Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).
- Bruggemann, E. P., Kayalar, C. Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).
- Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).
- Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange. Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).
- Gutknecht, J. Cadmium & thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).
- Ingólfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Curcumin is a modulator of bilayer material properties. Bioquímica. 46, 10384-10391 (2007).
- Keserü, G. M., Makara, G. M. The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).
- Leeson, P. D., Springthorpe, B. The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry. Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).
- Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).
- Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).
- Neher, E. Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion. Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).
- O’Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association. Science. 250, 1256-1259 (1990).
- Søgaard, R. GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity. Bioquímica. 45, 13118-13129 (2006).
- Waring, M. J. Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).
