Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften
Summary
Wir stellen Ihnen eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay, dass die Rate der Fluoreszenzlöschung als Maß für Gramicidin-Kanal-Aktivität überwacht. Die Gramicidin Kanäle sind als molekulare Kraftaufnehmer verwendet, um Änderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine zu überwachen.
Abstract
Viele Medikamente und andere kleine Moleküle zur Modulation biologischen Funktion sind Amphiphile, die Adsorption an der Doppelschicht / Lösung-Grenzfläche und damit Lipiddoppelschicht Eigenschaften zu verändern. Dies ist wichtig, weil Membranproteine energisch an ihre Host-Doppelschicht durch hydrophobe Wechselwirkungen gekoppelt. Änderungen in Doppelschicht Eigenschaften verändern somit membrane protein-Funktion, die einen indirekten Weg für Amphiphile modulieren Protein-Funktion und einen möglichen Mechanismus für "off-target" Arzneimittelwirkungen zu Verfügung stellt. Wir haben bereits eine elektrophysiologische Assay zum Nachweis von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften mittels linearer Gramicidin Kanäle als Sonden 3,12 entwickelt. Gramicidin-Kanäle sind Mini-Proteine durch die Transbilayer Dimerisierung von zwei nicht-leitenden Untereinheiten gebildet. Sie reagieren empfindlich auf Veränderungen in ihrer Membran-Umgebung, die ihnen leistungsfähige Sonden zur Überwachung von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine macht. Wir zeigen jetzt, ein Fluoreszenz-Assay zum Nachweis von Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften mit den gleichen Kanälen wie Sonden. Der Test basiert auf der Messung der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzlöschung von Fluorophor-geladen große unilamellare Vesikel durch die Eingabe einer Quencher durch die Gramicidin-Kanäle auf. Wir nutzen die Fluoreszenz-Anzeige / Quencher-Paar 8-Aminonaphthalin-1 ,3,6-trisulfonat (ANTS) / Tl. +, Mit der bereits in anderen Fluoreszenzlöschung Assays 5,13 verwendet Tl + durchdringt die Lipid-Doppelschicht langsam 8, sondern geht leicht durch die Durchführung Gramicidin Kanäle 1,14. Die Methode ist skalierbar und eignet sich sowohl für mechanistische Studien-und High-Throughput-Screening von kleinen Molekülen für Doppelschicht-stören, und das Potenzial "off-target", Effekte. Wir finden, dass die Ergebnisse mit dieser Methode in guter Übereinstimmung mit früheren elektrophysiologischen Ergebnisse 12 sind.
Protocol
Discussion
Wir haben eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay für die Bestimmung der Doppelschicht Änderung Potential von Medikamenten und anderen kleinen Amphiphile demonstriert. Verbindungen, die Doppelschicht Eigenschaften zu verändern dürften membrane protein-Funktion in eine indirekte, unspezifische Art und Weise verändern, möglicherweise einen Beitrag zur "off-target" Arzneimittelwirkungen. Der Test nutzt die Leistung von Gramicidin Kanäle als Sonden für die Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften <s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Michael J. Bruno, Radda Rusinova und Jon T. Sack für viele anregende Diskussionen. Finanzielle Unterstützung von NIH, R01GM021342 und ARRA ergänzen R01GM021342-35S1 und die Josiah Macy, Jr. Foundation OSA, die Tri-I CMB-Programm für HII, und die Iris L. und Leverett S. Woodworth Medical Scientist Fellowship und NIH MSTP gewähren GM07739 für RK.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
| gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
| PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |
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