Usando ponta fina micropipetas injetamos DNA plasmídeo em subdomínios de somitos frango ou tubos neural. A concentração do plasmídeo é ajustada para gerar única células transfectadas. Em seguida, permitir que as células de se transformar em populações clonais.
Abstract
Um tema central em biologia do desenvolvimento é a diversificação de linhagens ea elucidação dos mecanismos subjacentes molecular. Isto implica uma análise profunda dos destinos de uma única célula em condições normais e experimentais. Para este fim, métodos de transfecção que visam única progenitores são um pré-requisito. Descrevemos aqui um método tecnicamente simples para transfecting células individuais em tecidos de frango in-ovo, permitindo que a linhagem confiável de rastreamento, bem como a manipulação genética. Domínios tecidos específicos são direcionados dentro do somito ou tubo neural, e DNA é injetado diretamente no epitélio de interesse, resultando em transfecção de células individuais esporádicos. Usando repórteres, populações clonais pode conseqüentemente ser seguido por até três dias, e comportamento de populações geneticamente manipulados clonal pode ser comparada com a de controles. Este método aproveita a acessibilidade do embrião de galinha juntamente com ferramentas emergentes para a manipulação genética. Nós comparar e discutir suas vantagens sobre o método de eletroporação amplamente utilizado, e possíveis aplicações e uso em mais in-vivo modelos são também sugeridas. Defendemos o uso deste método como um acréscimo significativo e complementar para os actuais linhagem rastreamento e ferramentas de interferência genética.
Protocol
1. Preparação de Micropipetas Puxamos nossas pipetas em um padrão Narishige pp-83 pipeta extrator com uma configuração de calor de 13,5. A definição precisa deve ser calibrado, visando um diâmetro ponta da pipeta de 8 a 10 microns. Usamos filamento contendo tubos de vidro de borosilicato com um diâmetro exterior de 1,0 mm e diâmetro interno de 0,75-0,78 mm. As pipetas são, consequentemente, armazenados em um prato de plástico com as pontas protegidas do contato com as bordas do pra…
Discussion
O método descrito acima é uma modificação de uma técnica descrita anteriormente para a entrega de corantes lipofílicos para subpopulações de células pequenas ou progenitores única 3. Ele tem três grandes vantagens sobre a técnica de eletroporação padrão. Primeiro, ele fornece um meio para a rotulagem com sites de confiança discretas em tecidos-alvo, permitindo maior resolução espacial do que eletroporação (ver, por exemplo, Figura 1B, C). Segundo, que permite a rotulagem de uma única cél…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Shlomi Krispin para a imagem do tubo neural. Em particular, reconhecemos Yuval canela para iniciar a técnica de transfecção GFP. Este trabalho foi financiado por concessões do Ciência Israel Foundation, Francaise Associação Miopatias contre les, e Forschungsgemeinshaft Deutche, Centro de Pesquisa Colaborativa 488 CK