In vivo Visualisering av Synaptic Blåsor Inom Drosophila Larvernas segment Axoner
Summary
Detta protokoll behandlar leva dissektion av<em> Drosophila</em> Larver för att avbildning förflyttningen av GFP taggade axonal blåsor på mikrotubuli spår.
Abstract
Belysa mekanismerna för axonal transport har visat sig vara mycket viktigt för att avgöra hur fel i långväga transporter påverkar olika neurologiska sjukdomar. Defekter i denna viktiga process kan ha skadliga effekter på neuronal funktion och utveckling. Vi har utvecklat en dissektion protokoll som utformats för att utsätta<em> Drosophila</em> Larver segmentella nerver för att visa axonal transport i realtid. Vi har anpassat detta protokoll för live avbildning från en publicerad av Hurd och Saxton (1996) används för immunolocalizatin av larver segmentell nerver. Noggrann dissektion och rätt förutsättningar buffert är kritiska för att maximera livslängden på dissekeras larver. När ordentligt gjort, har dissekerat larver visat robust vesikler transporter i 2-3 timmar under fysiologiska förhållanden. Vi använder UAS-GAL4 metod<sup> 1</sup> Att uttrycka GFP-märkta APP eller synaptotagmin blåsor inom ett enda axon eller många axoner i larvernas segmentella nerver med hjälp av olika neuronala GAL4 förare. Andra fluorescerande taggade markörer, exempelvis mitokondrierna (MitoTracker) eller lysosomer (LysoTracker), kan även appliceras på larverna innan visning. GFP-vesikler rörelse och partikel rörelser kan visas samtidigt med separata våglängder.
Protocol
Discussion
In vivo avbildning av synaptiska vesikler transporter inom Drosophila larver segmentella nerver är ett kraftfullt verktyg för att studera de mekanismer i axonal transport. Vi har tidigare använt detta protokoll för att utvärdera transporter dynamiken på larver nerver som uttrycker expanderat polyQ upprepar att belysa hur expansionen av upprepar att påverka dynamiken i vesikler transporter 3. Med hjälp av detta protokoll hastigheten i vesikler rörelse kan bestämmas genom att omvandl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SG stöds av medel från State University of New York at Buffalo och från John R. Oishei Foundation.
MK fick stöd av en Student Forskning Award av CURCA på UB.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Scientific | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | ||
| 2 Pair Forceps | Fischer Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | ||
| Box of Dissection Pins | Fine Scientific | Minutien Pins 0.1mm diameter |
Referências
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genética. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
