عزل الخلايا البطانية صمامي
Summary
نحن نقدم طريقة لعزل وزراعة السكان نقية من خلايا صمام القلب البطانية (مركزنا). يمكن عزل مركزنا من جانبي نتوء أو النشرة وبعدها مباشرة ، الخلية الأساسية خلالي (VIC) العزلة واضح ومباشر.
Abstract
صمامات القلب هي وحدها المسؤولة عن الحفاظ على اتجاه وتدفق الدم من خلال نظام القلب والأوعية الدموية. وتتعرض هذه رقيقة ، والأنسجة الليفية للضغوط ميكانيكية كبيرة لأنها تفتح وتغلق عدة مليارات من المرات على مدى العمر. على التحمل لا تصدق من هذه الأنسجة ويرجع ذلك إلى صمامي المقيمين البطانية (VEC) وخلايا الخلالية (VIC) أن إصلاح وإعادة تشكيلها باستمرار استجابة للإشارات المحلية الميكانيكية والبيولوجية. إلا في الآونة الأخيرة بدأنا لفهم السلوكيات الفريدة لهذه الخلايا ، والتي في التجارب المختبرية لعبت دورا رئيسيا. لا سيما التحدي هو العزلة وثقافة مركزنا. يجب توخي الحذر خاصة من لحظة إزالة الأنسجة من المضيف من خلال الطلاء النهائية. هنا نقدم بروتوكولات العزل المباشر ، والعزلة جانب معين ، والثقافة ، والتحقق من السكان نقية من مركزنا. نستخدم الهضم الأنزيمي تليها تقنية مسحة رقيقة تجريف لإزاحة الخلايا السطحية فقط. ثم يتم جمع هذه الخلايا في أنبوب وطرد الى بيليه. هو معلق ثم بيليه ومطلي في قوارير ثقافة ما قبل المغلفة مع مصفوفة أنا الكولاجين. وأكد مركزنا النمط الظاهري كبح النمو عن طريق الاتصال والتعبير عن علامات معينة مثل البطانية PECAM1 (CD31) ، عامل فون ويلبراند (vWF) ، والتعبير السلبي للأكتين ألفا العضلات الملساء (α – SMA). وترتبط الخصائص الفنية للمركزنا مع مستويات عالية من LDL الأسيتيل. خلافا لخلايا بطانة الأوعية الدموية ، ومركزنا في قدرة فريدة على التحول الى اللحمة المتوسطة ، والذي يحدث عادة خلال تشكيل صمام الجنينية 1. وهذا يمكن أن يحدث أيضا أثناء فترات طويلة متموجة كبير آخر في الثقافة المختبر ، لذلك ينبغي بذل العناية لمرور عند أو بالقرب من نقطة التقاء. بعد عزلة مركزنا ، يمكن عندئذ السكان نقية من VIC الحصول عليها بسهولة.
Protocol
Discussion
وقد ضعف فهم البيولوجيا صمامي بسبب الصعوبات التقنية وعزل السكان زراعة نقي من الخلايا البطانية صمامي. تقنيات العزل نموذجية تشمل الهضم الأنزيمي من المصفوفة القاعدية الأساسية الكيميائية أو تفارق من السندات لاصقة 2،3 البطانية. وقد تم تقييم التجارب نوعيا العزلة الأ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا البحث من قبل على جائزة التوظيف جبهة الخلاص الوطني ، ومؤسسة هارتويل ، وجمعية القلب الأميركية (# 0830384N).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
Referências
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N. Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro. Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).
- Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin. J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).
- Cheunyg, W. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).
- Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).
- Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves. Circ Res. 96, 792-799 (2005).
- Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).
- Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2. Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Shi, Q. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 107, 1164-1169 (2003).
