Aislamiento de células endoteliales valvular
Summary
Ofrecemos un método para aislar y cultivar las poblaciones puras de células endoteliales de la válvula del corazón (VEC). VEC puede ser aislada de uno y otro lado de la cúspide o el prospecto e inmediatamente después, las células intersticiales de base (CIV) aislada es muy sencillo.
Abstract
Las válvulas del corazón es el único responsable de mantener el flujo de sangre unidireccional a través del sistema cardiovascular. Estos tejidos finos y fibrosos están sometidas a importantes tensiones mecánicas que pueden abrir y cerrar miles de millones de veces durante un período de vida. La increíble resistencia de estos tejidos se debe a la residencia del endotelio valvular (VEC) y las células intersticiales (VIC) que constantemente la reparación y remodelación en respuesta a las señales mecánicas y biológicas. Sólo recientemente hemos comenzado a comprender los comportamientos únicos de estas células, por lo que la experimentación in vitro ha jugado un papel clave. Especialmente difícil es el aislamiento y cultivo de VEC. Especial cuidado se debe utilizar desde el momento en que se extirpa el tejido del huésped a través de revestimiento final. Aquí se presentan los protocolos para el aislamiento directo, aislamiento secundarios específicos, la cultura, y la verificación de las poblaciones puras de VEC. Usamos la digestión enzimática seguida de una técnica de raspado suave esponja para separar las células en la superficie. Estas células son luego recogidos en un tubo y se centrifuga en una pastilla. El pellet se resuspende entonces y se colocaron en frascos de cultivo pre-recubiertos con colágeno I de la matriz. Fenotipo VEC es confirmado por el contacto inhibe el crecimiento y la expresión de marcadores endoteliales específicos, tales como PECAM1 (CD31), Factor Von Willebrand (FVW), y la expresión negativa de la actina de músculo liso alfa (α-SMA). Las características funcionales de VEC se asocian con altos niveles de LDL acetilada. A diferencia de las células endoteliales vasculares, VEC tiene la capacidad única de transformarse en mesénquima, que normalmente ocurre durante la formación embrionaria de la válvula 1. Esto también puede ocurrir durante el confluente de manera significativa después de prolongados pt cultivo in vitro, así que el cuidado debe ser de paso o cerca de su confluencia. Tras el aislamiento VEC, poblaciones puras de VIC pueden ser fácilmente adquiridas.
Protocol
Discussion
La comprensión de la biología valvular se ha visto afectada por las dificultades técnicas de aislamiento y cultivo de poblaciones puras de células endoteliales valvular. Técnicas típicas de aislamiento implican digestión enzimática de la matriz subyacente basal o químicos de disociación de las uniones adhesivas endotelial 2,3. Los experimentos preliminares de aislamiento se evaluaron cualitativamente mediante la variación de los agentes de la disociación y el período de incubación. Los resultado…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación es apoyada por el premio CARRERA NSF, la Fundación Hartwell, y la Asociación Americana del Corazón (# 0830384N).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
Referências
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N. Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro. Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).
- Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin. J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).
- Cheunyg, W. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).
- Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).
- Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves. Circ Res. 96, 792-799 (2005).
- Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).
- Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2. Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Shi, Q. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 107, 1164-1169 (2003).
