Выделение и культуры Птичий Эмбриональные клетки-предшественники клапанные
Summary
Эта статья даст метод выделения и культивирования перепелиных или куриных HH14<sup> -</sup> Клапан эндокарда клеток и HH25 клапан подушки мезенхимальных клеток.
Abstract
Правильное формирование и функции эмбриональных сердечных клапанов имеет решающее значение для развития прогрессии. Раннем эмбриональном сердце U-образной формы из эндокарда окружении миокарда. Миокарда выделяет сердечного желе, гиалуронана богатых желатиновой матрице, в атриовентрикулярного (АВ) соединения и выходного тракта (OFT) просвета. На этапе HH14 valvulogenesis начинается тогда, когда подмножество эндокарда клетки получают сигналы из миокарда, эндокарда, чтобы пройти мезенхимальные трансформации (EMT), и вторгаться в сердечной желе. На этапе HH25 клапанной подушки полностью mesenchymalized, и именно это мезенхимы, что со временем формы клапанного аппарата и перегородки сердца. Понимание механизмов, которые инициируют и модулировать процесс дифференциации EMT и клеточной важны, потому что их связи с серьезными врожденными пороками сердца. В этом исследовании мы представляем методы, чтобы изолировать предварительно ЕМТ эндокарда и пост-EMT мезенхимальные клетки, которые являются двумя различными фенотипами ячейки prevalvular подушке. Предварительно ЕМТ эндокарда клетки можно культивировать с или без миокарда. После ЕМТ А. В. подушке мезенхимальных клеток можно выращивать внутри механически ограничены, или без стресса гели коллагена. Эти 3D-модели в пробирке имитировать ключевых событий клапанной морфогенный и полезны для деконструкции механизмы ранней и поздней стадии valvulogenesis.
Protocol
Discussion
Метод выделения эндокарда клетки из стадии HH14 – сердца, первоначально разработанная Раньян и Markwald обеспечивает контролируемое, в пробирке условия для изучения факторов, которые инициируют и модулируют эмбриональных ЕМТ 2. HH14 – эндокарда эксплантов культурный без…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование проводится при поддержке Фонда Хартвелл, Американской ассоциации сердца (ученый развития грант № 0830384N) и Фондом Leducq: митрального 07CVD04.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | ||
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | ||
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific | 2041S | ||
| 4-well culture plates | Nunc | 176740 | ||
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalgene | 566-0020 | ||
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR International | 25384-342 | ||
| Laboratory tape | VWR International | 89097-920 | ||
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | ||
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | ||
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | ||
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | ||
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | ||
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | |||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
Referências
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Biologia do Desenvolvimento. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Biologia do Desenvolvimento. 302, 256-256 (2007).
