Isolering och odling av aviär Embryonala Klaffel progenitorceller
Summary
Denna artikel kommer att erbjuda en metod för att isolera och odla vaktel eller kyckling HH14<sup> -</sup> Ventil endokardiell celler och HH25 ventil kudde mesenkymala celler.
Abstract
Korrekt bildning och funktion av embryonala hjärtklaffar är avgörande för utveckling progression. Den tidiga embryonala hjärtat är ett U-format rör av endokardiet omgiven av hjärtmuskeln. Myokardiet utsöndrar hjärt gelé, en hyaluronan-rika gelatinös matris, i atrioventrikulärt (AV) korsningen och utflöde (OFT) lumen. På scenen HH14 valvulogenesis börjar när en delmängd av endokardiell celler tar emot signaler från myokardiet genomgår endokardiell till mesenkymala transformation (EMT), och invadera hjärt gelé. På scenen HH25 den valvulär kuddarna är helt mesenchymalized, och det är denna mesenkym som till slut bildar valvulär och septal apparater i hjärtat. Att förstå de mekanismer som initierar och modulera processen med EMT och celldifferentiering är viktigt på grund av deras anknytning till allvarliga medfödda hjärtfel. I denna studie presenterar vi metoder för att isolera före EMT endokardiell och efter EMT mesenkymala celler, vilka är de två olika celler fenotyper av prevalvular dynan. Pre-EMT endokardiell celler kan odlas med eller utan hjärtmuskeln. Post-EMT AV-kudde mesenkymala celler kan odlas inne mekaniskt begränsad eller stressfri kollagen geler. Dessa 3D in vitro-modeller efterlikna nyckeln valvulär morphogenic händelser och är användbara för dekonstruerar mekanismer tidiga och sena skede valvulogenesis.
Protocol
Discussion
Metoden för att isolera endokardiell celler från scenen HH14 – hjärtan som ursprungligen utvecklades av Runyan och Markwald ger en kontrollerad, in vitro-miljö för att studera vilka faktorer som initierar och modulera embryonala EMT 2. HH14 – endokardiell explants odlade utan att hjärtmuskeln inte genomgå EMT utan biomekaniska eller biokemiska intervention. Om hjärtmuskeln är kvar på Explantation det kommer att signalera en delmängd av endokardiell celler genomgå mes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av Hartwell Foundation, American Heart Association (Scientist utveckling Grant # 0830384N) och stiftelsen Leducq: mitralis 07CVD04.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | ||
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | ||
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific | 2041S | ||
| 4-well culture plates | Nunc | 176740 | ||
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalgene | 566-0020 | ||
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR International | 25384-342 | ||
| Laboratory tape | VWR International | 89097-920 | ||
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | ||
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | ||
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | ||
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | ||
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | ||
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | |||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
Referências
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Biologia do Desenvolvimento. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Biologia do Desenvolvimento. 302, 256-256 (2007).
