Dieser Artikel wird eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Wachteln oder Huhn HH14<sup> -</sup> Ventil endokardiale Zellen und HH25 Ventil Kissen mesenchymalen Zellen.
Abstract
Korrekte Ausbildung und Funktion der embryonalen Herzklappen ist entscheidend für Entwicklungsfortschritt. Die frühe embryonale Herz ist ein U-förmiges Rohr von Endokard von Myokard umgeben. Der Herzmuskel sondert kardiale Gelee, ein Hyaluronan reichen gallertartige Matrix, in die atrioventrikulären (AV)-Übergang und Ausflusstrakt (OFT) Lumen. Im Stadium HH14 valvulogenesis beginnt, wenn eine Teilmenge von endokardiale Zellen Signale aus dem Myokard zu erhalten, unterziehen endokardiale mesenchymale Transformation (EMT) und dringen in das Herz-Gelee. Im Stadium HH25 die Klappen Kissen sind vollständig mesenchymalized, und es ist dieses Mesenchym, die schließlich bildet die Herzklappen und septalen Apparat des Herzens. Das Verständnis der Mechanismen, und initiieren modulieren den Prozess der EMT und Zelldifferenzierung sind wegen ihrer Verbindung zu schweren angeborenen Herzfehlern wichtig. In dieser Studie präsentieren wir Methoden vor, EMT endokardiale und post-EMT mesenchymalen Zellen, die die beiden verschiedenen Zell-Phänotypen der prevalvular Kissen sind zu isolieren. Pre-EMT endokardiale Zellen können mit oder ohne den Herzmuskel gezüchtet werden. Post-EMT AV Kissen mesenchymalen Zellen können in mechanisch eingeschränkt oder Stress-free Kollagengelen kultiviert werden. Diese 3D-in vitro-Modelle zu imitieren Schlüssel valvular morphogenic Veranstaltungen und sind für die Dekonstruktion der Mechanismen der Früh-und Spätstadium valvulogenesis nützlich.
Protocol
1. Vorbereitung Inkubieren fruchtbaren Wachtel oder Hühnereier zu Stufe 14 – (ca. 2 Tage) oder 25 (ca. 4,5 Tage) bei 60% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C. Bereiten Sie sterile Earls Balanced Salt Solution (EBSS) Add 100 ml 10x EBSS zu 600 ml 18 MOhm Wasser Add 2,2 g Natriumbicarbonat Den pH-Wert der Lösung auf 7,2 Bringen Sie die Lösung bis zu 1000 ml Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter Bere…
Discussion
Das Verfahren zur Isolierung von Zellen aus endokardiale Bühne HH14 – hearts ursprünglich von Runyan und Markwald entwickelt eine kontrollierte, in vitro Umgebung, um die Faktoren, und initiieren modulieren embryonalen EMT-2-Studie. HH14 – endokardiale Explantate ohne Myokard kultiviert wird nicht unterziehen EMT ohne biomechanische oder biochemische Intervention. Wenn der Herzmuskel auf dem Explantat linken Seite ist es Signal eine Teilmenge von endokardiale Zellen mesenchyma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mitral 07CVD04: Diese Forschung wird von der Hartwell-Stiftung, der American Heart Association (Scientist Development Grant # 0830384N) und der Stiftung Leducq unterstützt.
Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (44), e2159, doi:10.3791/2159 (2010).