حقن آن. stephensi الجنين لتوليد الملاريا مقاومة البعوض
Summary
الأنوفيلة البعوض stephensi نواقل الملاريا في الهند والتي تسكن في جميع أنحاء آسيا. هذا الفيديو يوضح هذه التقنية لأداء microinjections من هذا النوع مع الجينات المحورة التي من شأنها أن تضفي على الملاريا المقاومة للبعوض. الكثير من منهجية تظاهروا في هذا الفيديو هو تطبيق لتقنيات microinjection أنواع أخرى من البعوض.
Abstract
إدخال جينات دخيلة في الجينوم من البعوض microinjection يتطلب تقنيات مصممة خصيصا لأنواع محددة من الفائدة. هذا البروتوكول الفيديو يوضح الطريقة المستخدمة من قبل المختبر جيمس microinject يبني الحمض النووي في الأجنة stephensi الأنوفيلة لجيل من البعوض المتحول. وتتجلى أساليب إعداد microinjection الإبر ، وجمع واعداد وتنفيذ الأجنة microinjection.
Protocol
إعداد مقدما من microinjection : البعوض الدم : للحقن من الاثنين إلى الأربعاء الإناث إطعام في يوم الجمعة السابق. لحقن الخميس والجمعة ، تتغذى على الإناث يوم الاثنين من الأسبوع نفسه. تعد الإبر كو?…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection Quartz needles | Sutter Instrument | O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller. | ||
| Quartz puller | Tool | Sutter Instrument Co | P-2000 | Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| EndoFree plasmid kit | Quiagen | |||
| Isopropanol | ||||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | for DNA cleaning | ||
| Construct DNA | 0.5 mg/ml | |||
| Helper plasmid | 0.3 mg/ml | |||
| Injection solution | Buffer | 1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Isotonic buffer | see recipe in the protocol section | |||
| Dessication oil | Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection. | |||
| Blood | to feed mosquitos | |||
| Anopheles stephensi | Animal | Mosquitos, male and female. | ||
| Drosophila culture vial | for egg laying | |||
| Petri dishes | with isotonic buffer, for embryo hatching | |||
| Fine paintbrush | Sable # 0000 | |||
| 3MM Whatman paper | ||||
| Forceps #5 | ||||
| double sided tape | ||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjector | Eppendorf | |||
| Microscope | Leica | with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification |
Citar este artigo
Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e216, doi:10.3791/216 (2007).