I denna video använder vi ett adenovirus bär Cre recombinase genen att infektera primära mus embryonala fibroblaster bär en floxed RAC1 allel.
Möjligheten att genetiskt ta bort vissa komponenter i olika kaskader cellsignalering har varit en integrerad verktyg i modern signaltransduktion analys. En särskild metod för att uppnå detta villkorade raderingen är via användning av Cre-loxP systemet. Denna metod innebär flankerar den gen av intresse med loxP platser som är särskilt erkännande sekvenser för Cre recombinase protein. Exponering av floxed sk (flankerad av loxP webbplats) DNA till detta enzym resulterar i en Cre-medierad rekombination event på loxP platser, och efterföljande excision av mellanperioden gen 3. Flera olika metoder finns för att administrera Cre recombinase till platsen av intresse. I denna video visar vi att använda ett adenovirus som innehåller Cre recombinase genen att infektera primära mus embryonala fibroblaster (MEFs) som erhållits från embryon som innehåller en floxed RAC1 allel 1. Vårt motiv för att välja RAC1 MEFs för vårt experiment är att tydliga morfologiska förändringar kan ses vid radering av RAC1, på grund av förändringar i aktin cytoskelettet 2,5. 72 timmar efter virus transduktion och Cre uttryck, var cellerna färgas med aktin färgämnet phalloidin och avbildas med konfokalmikroskopi laserskanning. Det konstaterades att MEFs som hade utsatts för Adeno-Cre viruset dök kontrakterade och långsträckta i morfologi jämfört med oinfekterade celler, i linje med tidigare rapporter 2,5. Det adenovirus metod för Cre recombinase leverans är fördelaktigt eftersom Adeno-Cre viruset är lätt tillgängliga, och gendeletion via CRE i nästan 100% av cellerna kan uppnås med optimerade adenovirala infektion.
Den medföljande video exemplifierar hur ett rekombinant virus kan användas för att punktskatt en specifik gen in vitro med hjälp av Cre recombinase. Utvecklingen av detta protokoll har dock avslöja några särskilda punkter värda att ta itu med.
Utöver granskningen av signalering kaskader i kultur, har Adeno-Cre tillvägagångssätt även varit anställd i vivo villkorligt bort gener från försöksdjur 3,4, och att märka vissa populationer av celler i en organism 6. Det adenovirus Systemet kan även anpassas för att introducera gener än Cre recombinase i värdceller. Två huvudsakliga fördelar med att använda denna leverans vektor är dess höga transduktion och genen leverans effektivitet och brist på integration med värd-DNA. Däremot kan den generation av nya rekombinanta Adenovirus vara arbetsintensiva. Protokollet som beskrivs här alltså utnyttjar kraften i den adenovirala systemet genom att utnyttja den tidigare utvecklade Adeno-Cre-virus, och kopplingen som med vår floxed allelen av intresse, RAC1. Genom denna villkorade slå ut experiment, har vi bekräftat att transduktion använder Adeno-Cre virus MEFs bär en floxed RAC1 allel faktiskt orsakar excision av RAC1 leder till förändringar av cellens morfologi kännetecknande för RAC1-brist celler 2,5.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Rizaldy Scott vid Mount Sinai Hospital i Toronto, Ontario för hans gåva av den primära RAC1 flox / flox musen embryonala fibroblaster. Detta arbete stöddes av driftsbidrag till New Jersey från den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2009 till 93.526) och Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC, RG 327.372 till 06). SH och MW stöds av CGSMA och CGS-M utmärkelser från CIHR och NSERC, respektive.
Steve Hawley och Melanie Wills bidragit lika för detta dokument.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | ||
DME High glucose media 500mL | Fisher | SH3002201 | ||
FBS Canadian origin 500mL | VWR | CAA15-701 | ||
PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher | SV30010 | ||
Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | ||
Trypsin | Sigma | T4549 |