इस वीडियो में, हम नीले देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन पृष्ठ) द्वारा multiprotein परिसरों (MPCs) के लक्षण वर्णन का वर्णन. पहली बार एक आयाम में, dialyzed सेलुलर lysates बीएन पृष्ठ के द्वारा अलग कर रहे हैं व्यक्तिगत MPCs की पहचान कर सकते हैं. एसडीएस पृष्ठ एक दूसरे आयाम में, ब्याज की MPCs आगे immunoblotting द्वारा उनके घटक विश्लेषण subdivided रहे हैं.
Multiprotein परिसरों (MPCs) संकेतन सेल में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, के बाद से सबसे अधिक प्रोटीन अन्य प्रोटीन के साथ कार्यात्मक या नियामक परिसरों (साली, Glaeser एट अल 2003.) में पाया जा सकता है है. इस प्रकार, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के अध्ययन MPCs का विस्तृत विशेषताओं की आवश्यकता है प्रोटीन समारोह और विनियमन के एक एकीकृत समझ पाने के लिए. पहचान और विश्लेषण के लिए, MPCs देशी शर्तों के तहत अलग किया जाना चाहिए. इस वीडियो में, हम नीले देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन पृष्ठ) द्वारा MPCs के विश्लेषण का वर्णन. बीएन पृष्ठ एक तकनीक है कि एक उच्च संकल्प की तुलना में जेल निस्पंदन या sucrose के घनत्व ultracentrifugation द्वारा की पेशकश की के साथ एक देशी रचना में MPCs की जुदाई की अनुमति देता है, और इसलिए उपयोगी है MPC आकार, संरचना, और रिश्तेदार बहुतायत (Schägger और वॉन Jagow 1991) निर्धारित है (Schägger, Cramer एट अल 1994.). इस विधि से, प्रोटीन उनके hydrodynamic आकार और एक polyacrylamide मैट्रिक्स में आकार के अनुसार अलग कर रहे हैं. यहाँ, हम कुल सेलुलर lysates के MPCs के विश्लेषण का प्रदर्शन, बाहर इशारा करते हुए कि lysate डायलिसिस बीएन पृष्ठ इन जैविक नमूनों को लागू करना महत्वपूर्ण कदम है. पहली आयाम बीएन और दूसरा आयाम एसडीएस पृष्ठ का एक संयोजन का उपयोग करना, हम बताते हैं कि बीएन पृष्ठ से अलग MPCs एसडीएस पृष्ठ से आगे जा सकता है अपनी व्यक्तिगत घटकों में subdivided. जेल जुदाई पर MPC घटकों के विज़ुअलाइज़ेशन मानक immunoblotting द्वारा किया जाता है. बीएन पृष्ठ द्वारा MPC विश्लेषण के लिए एक उदाहरण के रूप में, हम अच्छी तरह से विशेषता यूकेरियोटिक 19S, 20S, और 26S proteasomes चुना.
इस अध्ययन में, हम बीएन पृष्ठ से MPCs के विश्लेषण का वर्णन. एक 2D दृष्टिकोण देशी शर्तों के तहत पहले अलग MPCs प्रयोग किया जाता है, और फिर आगे अपनी व्यक्तिगत घटकों में उन्हें एक दूसरे आयाम एसडीएस पृष्ठ से प्रतिभाग करना.
नमूने सेल lysates से तैयार हैं. कई MPCs के solubilization के लिए, एक उचित डिटर्जेंट की जरूरत है, जो प्रोटीन परिसरों की संरचना को बरकरार रखता है. यहाँ, हम 0.1% Triton एक्स 100 का उपयोग करें. हालांकि, इष्टतम डिटर्जेंट और उसके उपयुक्त एकाग्रता empirically हर एमपीसी के लिए निर्धारित किया है. के मामले में ट्राइटन X-100, उदाहरण के लिए, यह बताया गया है कि कम डिटर्जेंट सांद्रता एफ 1 के एक dimeric फार्म की पहचान करने की अनुमति F-0-ATPase जटिल (अर्नोल्ड, Pfeiffer एट अल 1998 .). हायर ट्राइटन – एक्स 100 सांद्रता, तथापि, डिमर का पृथक्करण और monomeric 1 एफ एफ 0 ATPase परिसर के एक इसी वृद्धि करने के लिए नेतृत्व. यह हमारे पूर्व अध्ययन के साथ लाइन में है, हम दिखाने थे कि multivalent टी सेल रिसेप्टर परिसर (TCR) जब बृज 96 की कम सांद्रता के साथ निकाली संरक्षित है, जबकि उच्च एकाग्रता या किसी अन्य डिटर्जेंट के उपयोग में digitonin परिणाम बुलाया monomeric TCR (Schamel, Arechaga एट अल 2005.) के निष्कर्षण. आमतौर पर इस्तेमाल किया डिटर्जेंट है कि परीक्षण किया जा सकता digitonin (0.5 से 1%), Triton एक्स 100 (0.1 से 0.5%), 96 बृज (0.1 से 0.5%), या dodecylmaltoside (0.1 से 0.5%) शामिल हैं. इन अभिकर्मकों nonionic डिटर्जेंट, जो MPC स्थिरता के लिए सबसे अच्छा हो जाते हैं. पता है कि एसडीएस और अन्य मजबूत डिटर्जेंट के साथ संपर्क (केमाको Carvajal, Wollscheid एट अल 2004.) से बचा जाना चाहिए.
Lysates के डायलिसिस MPC एक बीएन जेल में जुदाई (केमाको – Carvajal, Wollscheid एट अल 2004) को प्राप्त करने की आवश्यकता है, (Heiss, Junkes एट अल 2005 .). ऐसा लगता है कि नमक एकाग्रता या कम आणविक भार दोष को हटाने के समायोजन के उच्च संकल्प के लिए महत्वपूर्ण है. यह उल्लेखनीय है कि झिल्ली की तैयारियाँ और MPCs, जो immunopurified किया गया है और बाद में एंटीबॉडी से eluted बीएन पृष्ठ के लिए उपयुक्त हैं (स्वामी, SIEGERS एट अल 2006.) . दोनों ही मामलों में, नमूने के बीएन पृष्ठ जुदाई लिए dialyzed हो सकता है, अगर झिल्ली lysis या elution बीएन lysis बफर में किया जाता है नहीं है.
बीएन पृष्ठ द्वारा प्रोटीन जुदाई के लिए, डाई Coomassie नीले जरूरत है, जो प्रोटीन के लिए unspecifically बांध और उन्हें नकारात्मक आरोप के साथ शामिल है. इस प्रकार, Coomassie नीले तटस्थ पीएच (Schägger और वॉन Jagow 1991) पर कैथोड की ओर प्रोटीन के electrophoretic गतिशीलता सक्षम बनाता है, (Schägger, Cramer एट अल 1994.). इसके अलावा, Coomassie नीले वैद्युतकणसंचलन दौरान stacking जेल में प्रोटीन एकत्रीकरण रोकता है. बीएन पेज के लिए, Coomassie G250 Coomassie नीले R250 या कोलाइडयन Coomassie ब्लूज़ के बजाय इस्तेमाल किया जा है.
बीएन – जेल चलाने से पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि जेल का प्रतिशत ब्याज की MPC की उम्मीद आकार फिट बैठता है. अलग gradients और उपयुक्त बफ़र्स Invitrogen (NativePAGE Novex बीआईएस Tris जेल सिस्टम) से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं के साथ बी एन – जैल मिल में बना हुआ है. लेकिन बीएन जैल भी एक persistaltic पंप के साथ एक साथ एक ढाल मिश्रक का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है. एक अक्षुण्ण ढाल की गारंटी करने के लिए, तरल डालने के लिये और बुलबुले से परहेज किया जाना चाहिए के दौरान लगातार प्रवाह चाहिए. हम जेल पर अलग नमूना dilutions की लोडिंग की सलाह देते हैं क्योंकि ओवरलोडिंग वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन की वर्षा के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, बी एन – जैल 4 में चलाने होना चाहिए ° सी प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए और MPCs को बरकरार रखने.
बाद बीएन पृष्ठ MPCs के दृश्य Coomassie शानदार नीले धुंधला हो जाना, चांदी धुंधला हो जाना या immunoblotting द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. प्रोटीन बैंड Coomassie या चांदी धुंधला द्वारा visualized मास स्पेक्ट्रोमेट्री (केमाको Carvajal, Wollscheid एट अल 2004.) द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. Immunoblotting के मामले में, ब्याज की MPCs के लिए इष्टतम हस्तांतरण शर्तों empirically निर्धारित किया है. पता है कि Coomassie नीले रंग भी एक बीएन जेल की सोख्ता के दौरान स्थानांतरित किया है. इसलिए, सफल स्थानांतरण के बाद जेल बेरंग हो, जबकि झिल्ली एक नीले रंग लागू होगा. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है उल्लेख है कि नहीं हर प्राथमिक, एंटीबॉडी, जो एसडीएस पृष्ठ के बाद पता लगाने के लिए काम करता है बीएन पृष्ठ पर immunoblotting के लिए लागू है. यह हो सकता है कि एंटीबॉडी ब्याज की MPC पहचान नहीं है क्योंकि उनके मिलान प्रोटीन के देशी रचना में छिपा हुआ है. इस समस्या को दूर करने के लिए, यह संभव है कि शीघ्र ही जेल 1x एसडीएस नमूना बफर में उबलते द्वारा हस्तांतरण करने के लिए पहले बी एन – जेल के भीतर प्रोटीन denature.
हमारे उदाहरण में, हम प्रोटीन बैंड का पता लगाने के के लिए बीएन जेल सीधे अधीन नहीं था. इसके बजाय, हम आगे एक दूसरे dimensi द्वारा बी.एन. पृष्ठ अलग lysate विभाजितएसडीएस-पृष्ठ पर. दूसरा आयाम एसडीएस जेल में, monomeric प्रोटीन एक अतिशयोक्तिपूर्ण पहला और दूसरा आयाम (केमाको Carvajal, Wollscheid एट अल 2004.) में रैखिक जेल में ढाल जेल के कारण विकर्ण के भीतर विस्थापित . यह MPCs की आसान पहचान की अनुमति देता है, क्योंकि वे इस अतिपरवलयिक विकर्ण नीचे स्थानीयकृत हैं. एक अलग एमपीसी के subcomponents दूसरा आयाम एसडीएस पृष्ठ में एक ऊर्ध्वाधर पंक्ति में अलग हैं. अवयव है कि कई dinstinct MPCs के घटक हैं एमपीसी के आकार के अनुसार एक क्षैतिज रेखा पर पहचाना जा सकता है है. हालांकि, यह माना जा है कि कई प्रोटीन एक ऊर्ध्वाधर पंक्ति में प्रदर्शित होने धब्बे भी अलग परिसरों कि बीएन पृष्ठ में एक ही स्थान पर विस्थापित का हिस्सा हो सकता है. अंतिम सबूत है कि वे एक ही MPC में मौजूद हैं एक एंटीबॉडी आधारित जेल शिफ्ट परख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इस परख में, एक एंटीबॉडी के साथ सेलुलर lysate बी.एन. पृष्ठ करने के लिए पहले एक पहचान स्थलों में से एक द्वारा प्रतिनिधित्व प्रोटीन के खिलाफ incubated है. सभी MPCs है कि एक उच्च आणविक जन की ओर पहला आयाम में इस प्रोटीन होते हैं के एक पारी में यह परिणाम है. अन्य प्रोटीन भी है कि इन MPCs का एक हिस्सा हैं इस जटिल विशिष्ट बदलाव से गुजरना और इसलिए कर रहे हैं दूसरा आयाम एसडीएस जेल में पहचान के लिए आसान होगा.
न केवल MPCs की संरचना बीएन – PAGE द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है लेकिन उनके stoichiometry का निर्धारण संभव है (Schamel और Reth 2000); (2001 Schamel), (स्वामी, Minguet एट अल 2007.). इस प्रयोजन के लिए, एक NAMOS परख (देशी एंटीबॉडी आधारित परख गतिशीलता पारी) किया जा सकता है. एंटीबॉडी आधारित जेल शिफ्ट परख में के रूप में, सेलुलर lysates मोनोक्लोनल सबयूनिट विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ incubated हैं. यह बीएन जैल में electrophoretic immunoshifts की प्रेरण है जो बदलाव की हद तक से MPCs के stoichiometry पर निष्कर्ष अनुमति देते हैं होता है
Conlusion में, बीएन पृष्ठ MPCs की पहचान और उनके आकार, संरचना, के रूप में अच्छी तरह से रिश्तेदार बहुतायत के निर्धारण के लिए उपयुक्त है. एक NAMOS परख के रूप में प्रदर्शन किया, यह भी के लिए एक निश्चित एमपीसी के stoichiometry निर्धारित करने की संभावना प्रदान करता है. अपनी सामान्य प्रयोज्यता को देखते हुए, इस तकनीक MPCs (Dekker, मुलर एट अल 1996) के लक्षण वर्णन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, (Wittig और Schagger 2008); (वैगनर, Rehling एट अल 2009.); (Wittig और Schägger 2009) .
The authors have nothing to disclose.
हम माइकल Reth, हरमन Schägger, और वैज्ञानिक समर्थन के लिए केमाको – Carvajal Margarita धन्यवाद. इस काम से Bundesministerium fuer Bildung और Forschung (BMBF) FORSYS द्वारा वित्त पोषित किया गया था ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से BIOSS द्वारा, और जर्मन संघीय और राज्य सरकारों की उत्कृष्टता पहल (GSC 4, Spemann ग्रेजुएट स्कूल द्वारा भाग में समर्थित ).