יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים לכמת שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. אסטרטגיה זו שימושית כדי לזהות מחזור התא של חיים ארוכים רקמות, שינוי בשעור, או מעבר, הגברה תאים.
מדידה מדויקת של חלוקת התא היא אתגר בסיסי בביולוגיה ניסויית זה הופך מורכב יותר ויותר לאט כאשר התאים המתחלקים מנותחים. שיטות הוקמה כדי לזהות חלוקת התא כוללים להדמיה ישירה על ידי מיקרוסקופית מתמדת תרבית תאים, דילול של צבעים חיוניים כגון carboxyfluorescein di-aetate succinimidyl אסתר (CFSE), חיסונית זיהוי של אנטיגנים mitogenic כגון ki67 או PCNA ו אנלוגים thymidine. אנלוגים Thymidine ניתן להבחין באמצעות מגוון שיטות לרבות זיהוי רדיו עבור thymidine tritiated, חיסונית לגילוי bromo-deoxyuridine (BrdU), כלורו-deoxyuridine (CldU) ו-iodo deoxyuridine (IdU), וזיהוי כימיים ethinyl-deoxyuridine (EDU). יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine שונים (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת לחוקרים לכמת במדויק שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. לפי פרוטוקולים immunostaining אופטימיזציה הגישה שלנו יכולה לזהות נמוך מאוד thymidine מנה אנלוגים מנוהל באמצעות מי השתייה, בטוח לנהל לעכברים לתקופות ממושכות של זמן. כתוצאה מכך, הטכניקה שלנו יכולה לשמש כדי לזהות תחלופת התאים ברקמות מאוד האריכה ימים. אופטימלית תוצאות מכתים immunofluoresent ניתן להשיג סוגי רקמות מרובות, כולל הלבלב, העור, המעי, הכבד, הכליות, אשך, שחלות, בלוטת התריס, בלוטת לימפה, מוח. יש לנו גם ליישם את הטכניקה הזו כדי לזהות שינוי בשעור בתוך רקמות. יש לנו יותר ליישם את הטכניקה הזאת כדי לקבוע אם המעבר, הגברה תאים לתרום לצמיחה או התחדשות של רקמות. במובן זה, הממשל רציפים של אנלוגים thymidine מייצג גישה חדשנית לחקר מקורותיו ואת ההישרדות של תאים מעורבים הומאוסטזיס רקמות.
הגישה שלנו להתקרב thymidine מבוסס תיוג מחזור התא יש יישומים פוטנציאליים רבים במחקר ביו. עד כה, אנחנו מתרכזים בלבלב, אבל יש לנו גם ליישם אסטרטגיה זו לבחון תחלופת התאים של העור, המעי, הכבד, הכליות הכליה, אשך, שחלות, בלוטת התריס, בלוטת לימפה, hematopoiesis, המוח 1. בגלל תחלופת התאים נע בין רקמה לרקמה, אסטרטגיות תיוג צריך להיות מותאם אישית כדי להשיג את המידע משכנעת ביותר מאיבר של עניין. מוריסון ועמיתיו השתמשו CldU ו IdU ליום 1 לכל תווית hematopoiesis 2. קון ועמיתיו להשתמש CldU ו IdU במשך 4 ימים כל לזהות חלוקת התא התחדשות שריר הלב 3. לעומת זאת, השתמשנו CldU ו IdU עד 9 חודשים סך תווית מחזור התאים הבזליים בתוך איים הלבלב, רקמה עם מחזור התא מינימלי כפי הגילאים חיה 1,4-6. יישום הפוטנציאל הברור ביותר של האסטרטגיה שלנו היא תיוג ללימודי להגדיר את תחלופת התאים בתוך רקמת הומאוסטזיס. אבל הטכניקה שלנו יש מספר יישומים פוטנציאליים אחרים. למשל, יש לנו גם להחיל לאחרונה בטכניקה זו כדי לזהות שינוי בשעור בתוך רקמות, שם מהמוקדים של שכפול מוגברת ניתן לזהות בקלות על ידי שילוב מוגבר של CldU או IdU 5. מוריסון ועמיתיו השתמשו CldU ו IdU ליום 1 כל לבדיקת התנהגות תווית שמירה של בתאי גזע hematopoietic 2. יש לנו גם להחיל thymidine רציפים אנלוגי תיוג כדי לקבוע אם המעבר, הגברה תאים לתרום לצמיחה או התחדשות של רקמות 1. בשנת הממשל יישום רציף של אנלוגים thymidine מייצג גישה חדשנית לחקר מקורותיו ואת ההישרדות של תאים מעורבים הומאוסטזיס רקמות.
אנלוגים Thymidine לא אמור לשמש ללא זהירות. אנלוגים סינתטיים thymidine יש פוטנציאל רעילות לתאי חלוקה, והשימוש בהן יכול תיאורטית לפגוע תחלופת התאים בבעלי חיים גוברת. אנלוגים Thymidine שימשו סוכני radiosensitizing למען ילדים חולי סרטן, ועלול להאט מחזור התא. לפיכך אנו קוראים לחוקרים לחקור בזהירות על פוטנציאל רעילות ברקמות העניין שלהם. לדוגמה, Trumpp ועמיתיו לגלות כי BrdU מערכתית יכול להכריח בתאי גזע hematopoietic להיכנס מחזור התא 7. למשל, ראטר ועמיתיו גילו כי מינון גבוה thymidine אנלוגים רעילים בפיתוח לבלב 8. לאחרונה Hellerstein ועמיתיו KineMed, Inc מצאו כי BrdU הממשל מאט תוך איון שגשוג על ידי 16-25% באמצעות תיוג קניינית כבד מים טכניקה 9. ההכנות איון שלם בשימוש על ידי Hellerstein ועמיתיו הכלול האנדוקרינית רבים אחרים סוגי תאים אנדוקריני שאינם, אשר יכול לכלול עד 50% ההכנות איון מוחלט. עם זאת, אנו מוצאים כי אינפוזיה ממושכת של BrdU אינו משפיע על בטא התפשטות תאים בעכברים בוגרים צעירים, כפי שהיא נמדדת על ידי ביטוי ki67 4. כמו כן, בטווח הארוך הממשל של CldU ו IdU לא נראה לפגום תא בטא המוני הרחבה 1. יתר על כן, בטא ריבוי שיעורי סלולריים הם המקבילה בין עכברים שכותרתו עם BrdU עבור תקופות זמן ארוכות ועכברים מסומנים רק לכמה שעות (שיעורי מנורמל לתקופות זמן שווה ערך). יחד, משתמע מתוצאות אלה כי עכברים יכולים לסבול בבטחה לטווח ארוך במינון נמוך הממשל של אנלוגים thymidine. ובכל זאת, אנחנו לא יכולים לשלול את פוטנציאל הרעילות של אנלוגים thymidine בצמיחה בטא בלבלב התא. כתוצאה מכך, אנו ממשיכים לבצע בקרות כאשר תיוג עכברים עם אנלוגים thymidine, והדחף חוקרים אחרים לעשות זאת גם כן.
הטכניקה שלנו של תיוג thymidine רציפים אנלוגי הוא לא בלי pitfalls ואתגרים טכניים. כתוצאה מכך, שקופיות בקרה חשובים במיוחד. יש לנו שנוצר שקופיות בקרה מורכב של רקמות שונות 1) עכברים תויגו רק עם CldU:.. 2) עכברים תויגו רק עם IdU;. 3) עכברים תויגו ברצף עם CldU ואז IdU;. 4) עכברים תויגו ברצף בסדר הפוך, קודם עם IdU ואז CldU;. 5) עכברים כי הם מדומה שכותרתו עם מים בלבד. כאשר לומדים תווית עם CldU ו IdU, החוקרים תמיד צריך לבצע את הפרוטוקול כולו עם כל 5 סטים של שקופיות מעל מרקמות של עניין.
תגובתיות בין קלה בין CldU ו IdU הוא החיסרון מצער אך בלתי נמנעים תיוג עם שני אנלוגים thymidine. הטכניקה CldU ו IdU מבוסס על ההבדלים זיקות בין antisera כי הופקו במקור מינים שונים (עכבר וחולדה) נגד BrdU. פרוטוקול שלנו, בעוד מסורבלת, נועד למזער את תגובתיות לחצות כזה. כתוצאה מכך, אנו ממליצים על זהירות בקרב חוקרים הרואים דילוג שלב (ים) של פרוטוקול. בפרט, יש לנונתקלו בבעיות עם antisera משנית כי הם תגובתי לעבור בין עכבר וחולדה. זה יכול להיות ממוזער על ידי שימוש antisera ג'קסון כי הם מלא צולבות adsorbed בין עכבר וחולדה.
מדי פעם אנו מצליחים לזהות כראוי ההתאגדות thymidine. במקרים כאלה הוא קריטי חשוב להשתמש בשקופיות בקרה חיובית כדי לקבוע איזה מגיב או צעד לא עבד. קשיים בדרך כלל עקב aliquots רע של antisera, מגלשות יבשות, או permeabilization גרעיני לקוי. נכשלנו בהצלחה תווית בפיתוח עוברים עם IdU. לפיכך, לא כל רקמות עשויה להיות חדיר IdU.
חלופות CldU ו IdU תיוג thymidine כפול אנלוגי הם באופק. EDU (5-ethinyl deoxyuridine-2) יכול להיות המצע של catalyzed זיהוי נחושת כימיה לחץ 10,11. שיטות זיהוי Edu אינם דורשים הפרדת גדילי דנ"א, ולפיכך הם נוחים מאוד לניתוח על ידי 12 cytometry הזרימה. Edu תואם, אך לא לחצות תגובתי עם BrdU 10. Edu שימש לכמת תחלופת התאים של רקמות שונות, כולל עכבר לתאי בטא בלבלב 13, בתאי המעי L 14 ו – 15 אפידרמיס. Edu יקר למדי כרגע ($ 1000 בארה"ב לכל 500 מ"ג). עם זאת, זיהוי Edu נראה הרבה יותר רגישים מאשר BrdU זיהוי 10. לכן, זה יכול להיות מבחינה כלכלית לשלב Edu ו BrdU במקום CldU ו IdU. שיטה זו עשויה גם לאפשר זיהוי של שלושה סיבובים שונים של חלוקת התא בעכברים שכותרתו פי שלוש עבור edu, CldU ו IdU.
לסיכום, הטכניקה שלנו תיוג thymidine רציפים אנלוגי היא גישה חדשנית לגילוי מחזור התא. אנו מקווים הגישה שלנו מאפשרת למדענים אחרים כדי לכמת בצורה מדויקת יותר חלוקת התא, ואנו מצפים שזה יהיה פתוח פרדיגמות חדשות הומאוסטזיס רקמות.
The authors have nothing to disclose.
נתמכים על ידי JDRF, ה-NIH (R01-DK081469), העמים של פנסילבניה (המרכז למצוינות הרגנרציה לרפואה מענק 4100043362), מצעד הפרוטות (בזיל אוקונור האשכול פרס מחקר מלומד), וכן אוניברסיטת פנסילבניה טייס DERC היתכנות מענק (DK19525).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedical | 0210547891 | ||
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | MP Biomedical | 0210035701 | ||
4% Paraformaldehyde | USB | 19943 | ||
10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | ||
XYLENES | VWR | EM-XX0060-4 | ||
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | ||
PBS, 10X Powder Concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | ||
Triton –X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
Hydrochloric Acid | VWR | BDH3028-2.5LG | ||
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | ||
Mouse Anti BrdU | BD Pharmingen | 347580 | ||
Rat mab anti BrdU | Accurate Chemical | OBT0030 | ||
Cy2 donkey anti-rat | Jackson Immuno | 712-225-153 | Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity). | |
Cy5 donkey anti-mouse | Jackson immuno | 715-175-151 | See above | |
Glass Cover Slips | Sigma-Aldrich | C9056-1CS | ||
YFP Filter | Chroma | 49003 ET EYFP | Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel | |
Cy3 Filter | Chroma | 49004 ET Cy3 | ||
Cy5 Filter | Chroma | 49006 ET Cy5 | ||
ORCA ER Microscope Camera | Hamamatsu | C4742-95-12ER | Excellent detection of fluorophores | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes). |