Cancer stamceller (CSCs) har identifierats i ett flertal maligniteter. I detta protokoll beskriver vi en flödescytometrisk metod att utnyttja aktivitet aldehyddehydrogenas och CD44 och CD24 uttryck för att isolera CSCs från mänsklig xenografter pankreas adenocarcinom. Dessa livsdugliga celler kan sedan användas i funktionella och analytiska studier.
Cancer stamceller (CSCs) har identifierats i ett växande antal maligniteter och är funktionellt definieras genom sin förmåga att genomgå självförnyelse och producera differentierade avkomma 1. Dessa egenskaper gör CSCs sammanfatta den ursprungliga tumören när det injiceras i nedsatt immunförsvar möss. CSCs inom en epiteliala maligniteter var första beskrivs i bröstcancer och funnit att visa specifik cell uttryck ytantigen (CD44 + CD24 låg / -) 2. Sedan dess har CSCs har identifierats i ett ökande antal andra mänskliga maligniteter med CD44 och CD24 samt ett antal andra ytantigener. Fysiologiska egenskaper, inklusive aldehyd dehydrogenas (ALDH) verksamhet har också använts för att isolera CSCs från maligna vävnader 3-5.
Nyligen identifierade vi och andra CSCs från pankreas adenocarcinom baserat på ALDH verksamhet och uttryck av antigenerna cellytan CD44 och CD24 och CD133 6-8. Dessa mycket tumörframkallande populationer kan eller inte kan vara överlappande och visa andra funktioner. Vi fann att ALDH + och CD44 + CD24 + bukspottkörteln CSCs är lika tumörframkallande, men ALDH + celler är relativt mer invasiv 8. I detta protokoll beskriver vi en metod att isolera livskraftiga bukspottkörteln CSCs från låg-passage mänskliga xenografter 9. Xenografted tumörer skördas från möss och göras till en encelliga suspension. Tissue skräp och döda celler avskiljs från levande celler och sedan färgas med hjälp av antikroppar mot CD44 och CD24 och använda ALDEFLUOR reagens, en fluorescerande substrat för ALDH 10. CSCs sedan isoleras med fluorescens aktiverad cell sortering. Isolerade CSCs kan sedan användas för analytiska och funktionella analysmetoder kräver livskraftiga celler.
Detta protokoll beskriver isolering av bukspottkörtelns CSCs från mänsklig xenografter. Flera viktiga steg i detta förfarande kommer att öka avkastningen av livskraftiga CSCs. Återhämtningen av en ren population av bukspottskörteln CSCs är beroende av renheten livskraftiga celler som finns i cellsuspensionen före sortering på FACSAria. Ta hand att använda xenografter som är mindre än 1-cm vid störst diameter bidrar till att minska mängden nekrotisk vävnad i mitten av tumören. Dessutom bryter ned cellsuspensionen av vävnad skräp och döda celler under Ficoll-Paque gradient centrifugering är kritisk och kan upprepas vid ett stort antal av vävnad skräp eller icke-viabla celler upptäcks när cellerna räknas på hemocytometer.
Den färgningsprotokollet beskrivs här utnyttjar ALDEFLUOR reagens systemet för att upptäcka ALDH verksamhet samt fluoroforen-konjugerade antikroppar för att påvisa specifika antigener på cellytan. ALDEFLUOR färgning sker vid 37 ° C och därför måste slutföras innan antikroppar färgning (på is) för att förhindra risken för antikroppar tak, vilket kan ske vid 37 ° C. Eftersom celler kan utflödet av ALDEFLUOR reagens, är det viktigt att bibehålla cellerna i ALDEFLUOR buffert vid 4 ° C efter ALDEFLUOR färgning har slutförts. Den ALDEFLUOR bufferten innehåller en hämmare efflux som bidrar till att upprätthålla intracellulära nivåer av ALDEFLUOR.
Eftersom denna metod isolerar livskraftig bukspottskörteln CSCs de kan tillämpas i ett antal experiment som mäter den fysiologiska funktionen av dessa celler. Vi har använt dessa celler för tumör-initiering analyser använder immunsupprimerade möss och in vitro cell migration / invasion analyser. Dessutom kan RNA, DNA och protein samlas in från dessa celler för analytiska studier som jämför CSC och icke-CSC befolkningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (CA127574, CA107040 och CA09071) till WM
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-118 | ||
Fetal calf serum | Harlan (Indianapolis, IN) | BT-9501 | ||
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Collagenase type IV | Invitrogen | 17104-019 | ||
Dispase | Sigma (St. Louis, MO) | D4818 | ||
100 x 20 mm culture dish | BD Biosciences (San Jose, CA) | 353003 | ||
70-μm filter | BD Biosciences | 352350 | ||
50-mL conical tube | BD Biosciences | 352070 | ||
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare (Upsala, Sweden) | 17-1440 | ||
ALDEFLUOR reagent system | Stem Cell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 01700 | ||
Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | ||
12 x 75 mm polystyrene test tubes | BD Biosciences | 352054 | ||
CD44-APC (clone G44-26) | BD Biosciences | 559942 | ||
CD24-PE (clone ML5) | BD Biosciences | 555428 | ||
Mouse CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | ||
Mouse lineage-biotin | Miltenyi Biotec (Auburn, CA) | 130-092-613 | ||
Mouse H-2Kd-biotin | BD Biosciences | 553564 | ||
IgG2bκ-APC | BD Biosciences | 555745 | ||
IgG2aκ-PE | BD Biosciences | 555574 | ||
Streptavidin-PerCP protein | BD Biosciences | 554064 | ||
Propidium iodide | Sigma | P4170 | ||
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps | BD Biosciences | 352235 |