إعداد مصفوفات شكوى لقياس تقلص الخليوي
Summary
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح التقنيات المستخدمة لصنع التجريبية ، متوافقة مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) ركائز مغلفة مناسبة لزراعة الخلايا ، والتي هي قابلة للالمجهري قوة الجر ومراقبة الآثار المترتبة على تصلب ECM على سلوك الخلية.
Abstract
تنظيم التصاق الخليوي الى المصفوفة خارج الخلية (ECM) ضروري للهجرة الخلايا وإعادة تصميم ECM. الالتصاقات البؤرية والجمعيات الجزيئات أن الزوجين مقلص F – أكتين الهيكل الخلوي للECM. يسمح هذا الصدد لنقل القوات الميكانيكية داخل الخلايا عبر غشاء الخلية إلى الركيزة الأساسية. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة الخصائص الميكانيكية للالتصاق ECM تنظيم الاتصال والتشكل F – أكتين فضلا عن العديد من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك تمايز الخلايا والانقسام ، والانتشار والهجرة. وهكذا ، أصبح استخدام خلايا من ركائز الثقافة السائدة وسيلة للسيطرة على وجه التحديد على نحو متزايد وتعدل الخصائص الميكانيكية ECM.
لقياس قوى الشد في الالتصاقات البؤرية في زنزانة ملتصقة ، يتم استخدام ركائز متوافقة بالتزامن مع التصوير ذات الدقة العالية والتقنيات الحاسوبية في أسلوب يطلق عليه قوة الجر المجهري (TFM). هذه التقنية تعتمد على قياسات لحجم واتجاه المحلية التشوهات الناجمة عن الانكماش الركيزة الخلوية. بالاشتراك مع عالية الدقة المجهر مضان من البروتينات الموسومة fluorescently ، فمن الممكن ربط تنظيم هيكل الخلية وإعادة عرض مع قوات الجر.
هنا نقدم بروتوكول مفصلة تجريبية لإعداد مصفوفات ، ثنائي الأبعاد متوافقة لغرض خلق ركيزة الثقافة الخلية مع صلابة جيدة تتميز ميكانيكية الانضباطي ، الذي هو مناسبة لقياس الانكماش الخلوية. هذه البروتوكولات تتضمن تصنيع بولي أكريلاميد الهلاميات المائية ، وطلاء للبروتينات ECM على هذه المواد الهلامية ، وخلايا الطلاء على المواد الهلامية ، وعالية الدقة باستخدام المجهر مبائر غرفة الارواء. بالإضافة إلى ذلك ، ونحن نقدم عينة تمثيلية من بيانات تظهر موقع وحجم القوات واستشهد الخلوية باستخدام بروتوكولات TFM.
Protocol
Discussion
الإجراء الموضح هنا للحصول على الإعداد لقوة الجر المجهري (TFM) تجربة ، جنبا إلى جنب مع تنفيذ إجراءات تتبع الحسابية (Sabass وآخرون ، 2008) ، ويسمح لتقدير حجم القوات الخليوي مع ميكرون النطاق المكاني القرار. لتحسين بروتوكول تجريبي ، فمن الأهمية بمكان أن تشكل الركيزة هلام نق…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مختبر شفارتز اولريش لتتبع البرامج الحاسوبية المستخدمة في القياس الكمي للقوات الجر الخلوية (Sabass وآخرون ، 2008). وأيد هذا العمل من قبل شهادة بوروز ويلكوم جائزة وجائزة مدير معاهد الصحة القومية في بايونير (DP10D00354) لغارديل ML القومي للبحوث الطبية والعلماء جائزة الخدمة (5 GM07281 T32) ليرة سورية الشتوية.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
| 40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
| 2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
| TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
| Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
| Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
| Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
Referências
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. e. w. m. a. n., Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. i. s. c. h. e. r. Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses. Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).
- Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).
- Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading. Biophys J. 89, 676-689 (2005).
- Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions. J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophys J. 94, 207-220 (2008).
- Yeung, T. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).
