शिकायत Matrices के सेलुलर संकुचन बढ़ाता लिए तैयार
Summary
इस वीडियो में, हम प्रयोगात्मक आज्ञाकारी, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) लेपित substrates सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीकों का प्रदर्शन, और जो कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी करने के लिए उत्तरदायी हैं और सेल के व्यवहार पर ECM कठोरता के प्रभाव को देख.
Abstract
सेलुलर आसंजन के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) विनियमन सेल प्रवास और ECM remodeling के लिए आवश्यक है. फोकल adhesions macromolecular विधानसभाओं कि सिकुड़ा एफ actin ईसीएम के लिए cytoskeleton जोड़े हैं. इस संबंध intracellular यांत्रिक बलों के कोशिका झिल्ली भर में अंतर्निहित सब्सट्रेट करने के लिए प्रसारण के लिए अनुमति देता है. हाल ही में काम दिखाया गया है ईसीएम के यांत्रिक गुणों फोकल आसंजन और एफ actin आकारिकी के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेल भेदभाव, विभाजन, प्रसार और प्रवास सहित कई शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित. इस प्रकार, सेल संस्कृति substrates के उपयोग में तेजी से प्रचलित विधि को ठीक नियंत्रण और ईसीएम यांत्रिक गुणों मिलाना बन गया है.
एक पक्षपाती कक्ष में फोकल adhesions पर कर्षण बलों यों, आज्ञाकारी substrates उच्च संकल्प इमेजिंग और एक विधि करार दिया कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी (TFM) में कम्प्यूटेशनल तकनीकों के साथ संयोजन के रूप में किया जाता है. इस तकनीक को स्थानीय परिमाण और सब्सट्रेट विकृतियों की दिशा सेलुलर संकुचन द्वारा प्रेरित के माप पर निर्भर करता है. Fluorescently टैग प्रोटीन का उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में, यह संभव है cytoskeletal और कर्षण बलों के साथ संगठन remodeling के सहसंबंधी.
यहाँ हम एक अच्छी तरह से विशेषता, tunable यांत्रिक कठोरता, जो सेलुलर संकुचन को मापने के लिए उपयुक्त है के साथ एक सेल संस्कृति सब्सट्रेट बनाने के उद्देश्य के लिए दो आयामी, आज्ञाकारी matrices की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल उपस्थित थे. ये प्रोटोकॉल polyacrylamide hydrogels के निर्माण, ऐसे जैल पर ECM प्रोटीन की कोटिंग, जैल पर चढ़ाना कोशिकाओं, और उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक छिड़काव चैम्बर शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, हम स्थान और सेलुलर उद्धृत TFM प्रोटोकॉल का उपयोग बलों के परिमाण का प्रदर्शन डेटा के एक प्रतिनिधि नमूने प्रदान करते हैं.
Protocol
Discussion
प्रक्रिया एक कर्षण बल (TFM) माइक्रोस्कोपी प्रयोग की स्थापना के लिए यहाँ वर्णित है, कम्प्यूटेशनल ट्रैकिंग दिनचर्या (Sabass एट अल., 2008) के कार्यान्वयन के साथ, माइक्रोन पैमाने पर स्थानिक संकल्प के साथ सेलुलर ब…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कम्प्यूटेशनल ट्रैकिंग सेलुलर कर्षण बल (Sabass एट अल., 2008) की मात्रा का ठहराव में इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के लिए Ulrich Schwarz की प्रयोगशाला धन्यवाद . यह काम एक Burroughs Wellcome कैरियर पुरस्कार और NIH निदेशक एमएल Gardel और चिकित्सा वैज्ञानिक राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा (GM07281 T32 5) पुरस्कार सपा शीतकालीन के लिए पायनियर पुरस्कार (DP10D00354) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
| 40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
| 2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
| TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
| Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
| Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
| Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
Referências
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. e. w. m. a. n., Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. i. s. c. h. e. r. Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses. Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).
- Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).
- Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading. Biophys J. 89, 676-689 (2005).
- Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions. J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophys J. 94, 207-220 (2008).
- Yeung, T. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).
