Mikroinjektion av A. aegypti Embryon Skaffa Transgena myggor
Summary
I denna video visar Nijole Jasinskiene de metoder som använts för att generera transgena Aedes aegypti myggor, som är vektorer för denguefeber. De tekniker för korrekt förbereda mikroinjektion nålar, uttorkning embryon och utföra mikroinjektion demonstreras.
Abstract
I denna video visar Nijole Jasinskiene de metoder som använts för att generera transgena Aedes aegypti myggor, som är vektorer för denguefeber. De tekniker för korrekt förbereda mikroinjektion nålar, uttorkning embryon och utföra mikroinjektion demonstreras.
Protocol
Preparat i förväg mikroinjektion Blod foder myggor: för injektion från måndag till fredag mata honorna på föregående torsdag. Förbered glaset nålar använder programmet 3 eller 2 (se material). Att lägga rör för embryon är Drosophila kultur flaskan. Blöt bomull i botten, med en våt disk av filtrerpapper som täcker det. Förbered plasthölje slinka genom att sticka dubbelsidig tejp på ena änden. Trimma tejp för att täcka glida så att den slutar vid kant…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x Injection solution | Buffer | 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Construct plasmid | DNA | 0.5 mg/ml. | ||
| Helper plasmid | DNA | 0.3 mg/ml | ||
| EndoFree Plasmid kit | Kit | Qiagen | ||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | To clean DNA. | ||
| Glass puller | Instrument | Sutter Instrument Co | Model P-87 | Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100. Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50 |
| Quartz puller | Instrument | Sutter Instrument Co | Model P-2000 | Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| Injection glass needles | Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument). | |||
| Aedes aegypti | Animal | Male and female mosquitos, to obtain embryos. | ||
| Drosophila culture vial | For mosquito egg-laying. | |||
| Halocarbon oil | Reagent | Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1) | ||
| Forceps No5 | Tool | |||
| Fine paintbrush | Sable | No. 0000 | ||
| Whatman paper | Tool | |||
| Microloader | Tool | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Transjector | Tool | Eppendorf | ||
| Microscope | Leica | With moving stage and micromanipulator. | ||
| 3MM Whatman paper | ||||
| double sided tape |
Citar este artigo
Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e219, doi:10.3791/219 (2007).