Test activité Protozoacidal du ligand-lytique peptides contre Gut Termite protozoaires In vitro (Culture protozoaires) et In vivo (Microinjection dans Termite Intestin postérieur)
Summary
Nous présentons les procédures pour démontrer que les ligands se lient à la membrane de surface des ces protozoaires digérant la cellulose-dans l'intestin des termites de Formose souterraines en utilisant la microscopie fluorescente et que les ligands couplés avec des peptides lytiques tuer les protozoaires<em> In vitro</em> (Anaérobie de la culture de protozoaires) et<em> In vivo</em> (Injection dans l'intestin postérieur des termites).
Abstract
Nous développons une nouvelle approche de lutte contre les termites souterrains qui conduirait à réduire la dépendance à l'utilisation de pesticides chimiques. Les termites souterrains sont dépendants des protozoaires dans le hindguts des travailleurs à digérer efficacement le bois. Peptides lytiques ont été capables de tuer une variété de parasites protozoaires (Mutwiri et al. 2000) et aussi des protozoaires dans l'intestin des termites de Formose souterraines, Coptotermes formosanus (Husseneder et Collier 2009). Peptides lytiques sont partie du système immunitaire non spécifique des eucaryotes, et de détruire les membranes des microorganismes (Leuschner et Hansel 2004). La plupart des peptides lytiques ne sont pas susceptibles de nuire les eucaryotes supérieurs, parce qu'ils n'affectent pas les membranes cellulaires électriquement neutre contenant du cholestérol des eucaryotes supérieurs (Javadpour et al. 1996). L'action lytique peptide peuvent être ciblées sur des types cellulaires spécifiques par l'ajout d'un ligand. Par exemple, Hansel et al. (2007) a rapporté que les peptides lytiques conjugués avec des ligands des récepteurs des cellules du cancer de membrane peuvent être utilisées pour détruire les cellules cancéreuses du sein, tandis que les peptides lytiques seul ou conjugué avec des non-peptides spécifiques n'ont pas été efficaces. Peptides lytiques ont également été conjugué à des hormones humaines qui se lient à des récepteurs sur les cellules tumorales pour destruction ciblée de cellules cancéreuses de la prostate et des testicules (Leuschner et Hansel 2004).
Dans cet article nous présentons les techniques utilisées pour démontrer l'activité protozoacidal d'un peptide lytique (Hecate) couplé à un ligand qui se lie à heptapeptide la membrane de surface des protozoaires de l'intestin des termites de Formose souterraines. Ces techniques comprennent extirpation de l'intestin des travailleurs contre les termites, la culture anaérobie de l'intestin protozoaires (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), confirmation microscopique que le ligand marqué avec un colorant fluorescent se lie à l'intestin des termites et autres protozoaires vivant librement protozoaires, mais pas à des bactéries ou tissu intestinal. Nous démontrons également que le même ligand couplé à un peptide lytique tue efficacement l'intestin des termites protozoaires in vitro (culture de protozoaires) et de vivo (micro-injection dans l'intestin postérieur des travailleurs), mais il est moins bactéricide que le peptide lytique seul. La perte de protozoaires conduit à la mort des termites en moins de deux semaines.
Dans le futur, nous allons modifier génétiquement des micro-organismes qui peuvent survivre dans l'intestin postérieur des termites et la propagation à travers une colonie de termites comme «cheval de Troie» pour exprimer ligand-lytique des peptides qui allait tuer les protozoaires dans l'intestin des termites et ensuite tuer les termites de la colonie . Ligand-lytique peptides pourrait également être utile pour le développement de médicaments contre les parasites protozoaires.
Protocol
Discussion
Ligand-lytique peptides ont été utilisés avec succès pour cibler efficacement et de détruire les cellules cancéreuses (Hansel et Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Basé sur ce concept, nous avons développé un ligand qui se lie à heptapeptide la surface de protozoaires dans l'intestin des termites souterrains de Formose et couplé à un peptide lytique dans le but de détruire ces n'oblige digérer la cellulose-symbiotes dans l'intestin des termites pour atteindre les termites contrôle (…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Allison Richard, ancien directeur de l'établissement peptide LSU pour la synthèse ligand fluorescent, le Centre de recherche en biotechnologie Interdisciplinaray, UF pour la synthèse peptidique ligand-lytique, et l'installation de microscope Socolovsky pour donner accès à des microscopes à fluorescence. Le financement a été fourni par le Programme de développement SERDP exploratoire pour demain (SEED) du ministère de la Défense, ministère de l'Énergie et de l'Environmental Protection Agency, le Programme de biotechnologie AgCenter équipe interdisciplinaire et l'État de Louisiane.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL-2 | ||
| EDANS | Novabiochem | |||
| Anaerobic glove box | Coy Laboratories, Inc. | Custom made | ||
| Intellus environmental controller | Percival | I36NL | ||
| PC-10 Glass micropipette puller | Narishige Scientific Instrument Lab | PC-10 | ||
| Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm) | Narishige Scientific Instrument Lab | GD-1 | ||
| Leitz micromanipulators | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | ||
| Microinjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | ||
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0005 | ||
| LEICA fluorescence imaging system | Leica | DMRxA2 | ||
| LEICA dissecting scope | Leica | MZ16 | ||
| LEICA microscope | Leica | DMLB | ||
| Olympus dissecting scope | Olympus | SZ61 |
Referências
- Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases. Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).
- Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. Paratransgenesis for termite control. Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).
- Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites. Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).
- Husseneder, C., Grace, J. K. Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).
- Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).
- Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera). Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).
- Leuschner, C., Hansel, W. Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments. Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).
- Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads. J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).
- Trager, W. The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa. Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).
