Testen Protozoacidal Activiteit van Ligand-lytische Peptiden Against Protozoa Termite Gut In vitro (Protozoa Cultuur) en In vivo (Micro-injectie in Termite einddarm)
Summary
We presenteren de procedures aan te tonen dat liganden binden aan het oppervlak membraan van de protozoa cellulose verterende protozoa in de darm van de Formosan ondergrondse termieten met behulp van fluorescentie microscopie en dat liganden gekoppeld aan lytische peptiden kill deze<em> In vitro</em> (Anaërobe protozoa cultuur) en<em> In vivo</em> (Injectie in de termiet einddarm).
Abstract
We ontwikkelen een nieuwe benadering voor ondergrondse termieten controle die zou leiden tot een verminderde afhankelijkheid van het gebruik van chemische bestrijdingsmiddelen. Ondergrondse termieten zijn afhankelijk van protozoa in het hindguts van de werknemers om efficiënt te verteren hout. Lytische peptiden is aangetoond dat een verscheidenheid van protozoaire parasieten (Mutwiri et al.. 2000) te doden en ook protozoa in de darm van de onderaardse ondergrondse termiet, Coptotermes formosanus (Husseneder en Collier 2009). Lytische peptiden zijn onderdeel van het niet-specifieke immuunsysteem van eukaryoten, en vernietigen de membranen van micro-organismen (Leuschner en Hansel 2004). De meeste lytische peptiden zijn niet waarschijnlijk dat hogere eukaryoten kwaad, omdat ze geen invloed hebben op de elektrisch neutrale cholesterol-bevattende celmembranen van hogere eukaryoten (Javadpour et al.. 1996). Lytische peptide actie kan worden gericht op specifieke celtypen door de toevoeging van een ligand. Bijvoorbeeld, Hansel et al. (2007). Meldde dat lytische peptiden geconjugeerd met kanker celmembraan receptor liganden kan worden gebruikt om borstkanker cellen te vernietigen, terwijl de lytische peptiden alleen of geconjugeerd met niet-specifieke peptiden werden niet effectief. Lytische peptiden ook zijn geconjugeerd aan menselijke hormonen die aan receptoren binden op tumorcellen voor gerichte vernietiging van prostaat-en teelbalkanker cellen (Leuschner en Hansel 2004).
In dit artikel presenteren we technieken die gebruikt worden om de protozoacidal activiteit van een lytische peptide (Hecate) gekoppeld aan een heptapeptide ligand dat bindt aan het oppervlak membraan van protozoa uit de darm van de onderaardse ondergrondse termiet te tonen. Deze technieken zijn uitroeiing van de darm van de termiet werknemers, anaërobe cultuur van de darm protozoa (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), microscopische bevestiging dat de ligand gemarkeerd met een fluorescerende kleurstof bindt aan de termiet darmen protozoa en andere vrijlevende protozoa maar niet om bacteriën of darmweefsel. We tonen ook aan dat dezelfde ligand gekoppeld aan een lytische peptide efficiënt termiet darm protozoa in vitro (protozoa cultuur) en in vivo (micro-injectie in de einddarm van de werknemers) doodt, maar is minder bacteriacidal dan de lytische peptide alleen. Het verlies van protozoa leidt tot de dood van de termieten in minder dan twee weken.
In de toekomst zullen we genetisch ingenieur micro-organismen die kunnen in de termiet einddarm en verspreid te overleven door middel van een termiet kolonie als 'Trojan Horses' op ligand-lytische peptiden die zou doden de protozoa in de termiet darm en vervolgens dood de termieten in de kolonie te drukken . Ligand-lytische peptiden ook nuttig kan zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen protozoaire parasieten.
Protocol
Discussion
Ligand-lytische peptiden zijn met succes gebruikt om effectief te richten en te vernietigen kankercellen (Hans en Leuschner 2004, Hansel et al. 2007).. Op basis van dit concept, ontwikkelden we een heptapeptide ligand dat bindt aan het oppervlak van protozoa in de darm van de Formosan ondergrondse termieten en gekoppeld aan een lytische peptide met het doel om deze obligate cellulose verterende symbionten in de darmen van termieten te vernietigen termieten te bereiken controle (Husseneder en Collier 2009).
…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Allison Richard, voormalig directeur van het LSU-peptide faciliteit voor de tl-ligand synthese, de Interdisciplinaray Center for Biotechnology Research, UF voor de ligand-lytische peptide synthese en de Socolovsky Microscoop faciliteit voor het verschaffen van toegang tot fluorescentie microscopen. De financiering werd verstrekt door de SERDP verkennende Development Program (SEED) van het ministerie van Defensie, Department of Energy and Environmental Protection Agency, de biotechnologie AgCenter Interdisciplinair Team Programma en de staat Louisiana.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL-2 | ||
| EDANS | Novabiochem | |||
| Anaerobic glove box | Coy Laboratories, Inc. | Custom made | ||
| Intellus environmental controller | Percival | I36NL | ||
| PC-10 Glass micropipette puller | Narishige Scientific Instrument Lab | PC-10 | ||
| Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm) | Narishige Scientific Instrument Lab | GD-1 | ||
| Leitz micromanipulators | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | ||
| Microinjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | ||
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0005 | ||
| LEICA fluorescence imaging system | Leica | DMRxA2 | ||
| LEICA dissecting scope | Leica | MZ16 | ||
| LEICA microscope | Leica | DMLB | ||
| Olympus dissecting scope | Olympus | SZ61 |
Referências
- Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases. Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).
- Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. Paratransgenesis for termite control. Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).
- Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites. Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).
- Husseneder, C., Grace, J. K. Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).
- Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).
- Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera). Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).
- Leuschner, C., Hansel, W. Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments. Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).
- Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads. J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).
- Trager, W. The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa. Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).
