Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm)
Summary
Wir präsentieren Verfahren für den Nachweis, dass Liganden binden an die Oberfläche Membran der Zellulose-Verdauung Protozoen im Darm von Termiten Formosan unterirdischen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und dass Liganden mit lytischen Peptiden gekoppelt töten diese Protozoen<em> In-vitro-</em> (Anaerobe Protozoen Kultur) und<em> In vivo</em> (Injektion in den Termiten Enddarm).
Abstract
Wir entwickeln einen neuartigen Ansatz zur unterirdischen Termiten, die zu verringerten Vertrauen auf den Einsatz von chemischen Pflanzenschutzmitteln führen würde. Subterranean Termiten sind abhängig von Protozoen in der hindguts der Arbeitnehmer auf effizient verdauen Holz. Lytische Peptide haben gezeigt, dass eine Vielzahl von einzellige Parasiten (Mutwiri et al. 2000) zu töten, und auch im Darm von der Formosa unterirdischen Termite, Coptotermes formosanus (Husseneder und Collier 2009) Protozoen. Lytische Peptide sind Teil des unspezifischen Immunsystems von Eukaryoten, und zerstören die Membranen von Mikroorganismen (Leuschner und Hänsel 2004). Die meisten lytische Peptide sind nicht geeignet, höheren Eukaryonten schaden, weil sie keinen Einfluss auf die elektrisch neutralen Cholesterin-haltigen Zellmembranen von höheren Eukaryonten (Javadpour et al. 1996). Lytische Peptid Aktion kann auf bestimmte Zelltypen durch die Zugabe eines Liganden ausgerichtet sein. Zum Beispiel berichtete Hansel et al. (2007), dass lytischen Peptiden konjugiert mit Krebs Zellmembran-Rezeptor-Liganden verwendet werden könnten, um Brustkrebszellen zerstört werden, während lytische Peptide allein oder konjugiert mit nicht-spezifische Peptide wurden nicht wirksam. Lytische Peptide wurden auch konjugiert menschlichen Hormonen, die an Rezeptoren binden auf Tumorzellen für die gezielte Zerstörung von Prostata-und Hodenkrebs-Zellen (Leuschner und Hänsel 2004).
In diesem Artikel präsentieren wir Techniken verwendet, um die protozoacidal Aktivität eines lytischen Peptids (Hecate) gekoppelt an ein Heptapeptid Liganden, der an der Oberfläche der Membran aus dem Darm der Formosa-Termite unterirdischen Protozoen bindet demonstrieren. Diese Techniken umfassen Ausrottung der Darm von Termiten Arbeiter, Protozoen anaerobe Kultur des Darms (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), mikroskopische Bestätigung, dass der Ligand mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, um den Termitendarm bindet Protozoen und andere frei lebende Protozoen, aber nicht um Bakterien oder Darmgewebe. Wir zeigen auch, dass der gleiche Wirkstoff gekoppelt an eine lytische Peptid effizient tötet Termitendarm in vitro (Protozoen Kultur) und in vivo (Mikroinjektion in Enddarm der Arbeitnehmer) Protozoen, ist aber weniger bacteriacidal als die lytische Peptid allein. Der Verlust der Protozoen führt zum Tod der Termiten in weniger als zwei Wochen.
In Zukunft werden wir genetisch Ingenieur Mikroorganismen, die in der Termite Enddarm und die Ausbreitung durch eine Termitenkolonie als "Trojanische Pferde" zu Ligand-lytische Peptide, die in der Termitendarm Protozoen zu töten und anschließend zu töten die Termiten in der Kolonie würde ausdrücken können überleben . Ligand-lytische Peptide auch nützlich sein könnte für die Entwicklung von Medikamenten gegen einzellige Parasiten.
Protocol
Discussion
Ligand-lytische Peptide wurden erfolgreich verwendet, um effektiv anzugreifen und zu zerstören Krebszellen (Hänsel und Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Basierend auf diesem Konzept entwickelten wir ein Heptapeptid Liganden, der an der Oberfläche bindet Protozoen im Darm von Formosa unterirdischen Termiten und gekoppelt an einen lytische Peptid mit dem Ziel, diese zu verpflichten Zellulose-Verdauung Symbionten im Darm von Termiten zu zerstören, um Termiten zu erreichen Steuerung (Husseneder und Collier 2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Allison Richard, ehemaliger Direktor des LSU-Peptid-Anlage für das fluoreszierende Liganden Synthese, die Interdisciplinaray Center for Biotechnology Research, UF für den Liganden-lytische Peptid-Synthese und die Socolovsky Mikroskop-Anlage für den Zugang zur Fluoreszenz-Mikroskopen. Die Finanzierung wurde durch die SERDP Exploratory Development Program (SEED) des Department of Defense, Department of Energy and Environmental Protection Agency, der Biotechnologie AgCenter Interdisziplinäres Team Programm und den Bundesstaat Louisiana zur Verfügung gestellt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL-2 | ||
| EDANS | Novabiochem | |||
| Anaerobic glove box | Coy Laboratories, Inc. | Custom made | ||
| Intellus environmental controller | Percival | I36NL | ||
| PC-10 Glass micropipette puller | Narishige Scientific Instrument Lab | PC-10 | ||
| Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm) | Narishige Scientific Instrument Lab | GD-1 | ||
| Leitz micromanipulators | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | ||
| Microinjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | ||
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0005 | ||
| LEICA fluorescence imaging system | Leica | DMRxA2 | ||
| LEICA dissecting scope | Leica | MZ16 | ||
| LEICA microscope | Leica | DMLB | ||
| Olympus dissecting scope | Olympus | SZ61 |
Referências
- Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases. Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).
- Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. Paratransgenesis for termite control. Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).
- Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites. Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).
- Husseneder, C., Grace, J. K. Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).
- Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).
- Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera). Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).
- Leuschner, C., Hansel, W. Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments. Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).
- Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads. J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).
- Trager, W. The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa. Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).
