Atividade de testes Protozoacidal Ligand-lítica Peptídeos Contra Gut Termite Protozoa In vitro (Cultura Protozoa) e In vivo (Microinjeção em Termite intestino grosso)
Summary
Apresentamos os procedimentos para demonstrar que ligantes se ligam à superfície da membrana de celulose de digestão destes protozoários no intestino de cupins subterrâneos Formosan por microscopia de fluorescência e que juntamente com peptídeos ligantes líticas matar protozoários<em> In vitro</em> (Cultura protozoários anaeróbios) e<em> In vivo</em> (Injecção no intestino posterior de cupins).
Abstract
Estamos desenvolvendo uma nova abordagem para controle de cupins subterrâneos que levam a dependência reduzida sobre o uso de pesticidas químicos. Cupins subterrâneos são dependentes de protozoários do hindguts de trabalhadores de forma eficiente digerir madeira. Peptídeos líticas têm sido mostrados para matar uma variedade de protozoários parasitas (Mutwiri et al. 2000) e também protozoários no intestino do cupim subterrâneo Formosan, Coptotermes formosanus (Husseneder e Collier 2009). Líticas peptídeos são parte do sistema imune inespecífica dos eucariotos, e destruir as membranas de microrganismos (Leuschner e Hansel, 2004). Peptídeos mais lítica não são susceptíveis de prejudicar eucariotos superiores, porque eles não afetam o eletricamente neutro membranas contendo colesterol das células de eucariotos superiores (Javadpour et al. 1996). Ação peptídeo lítico pode ser direcionada para tipos específicos de células pela adição de um ligante. Por exemplo, Hansel et al. (2007) relataram que os peptídeos líticas conjugado com câncer de células ligantes do receptor de membrana pode ser usada para destruir as células do câncer de mama, enquanto peptídeos líticas isoladamente ou conjugados com os não-específicas peptídeos não foram eficazes. Líticas peptídeos também foram conjugados aos hormônios humanos que se ligam a receptores nas células tumorais para a destruição específica de células cancerosas da próstata e testicular (Leuschner e Hansel, 2004).
Neste artigo apresentamos as técnicas utilizadas para demonstrar a atividade protozoacidal de um peptídeo lítico (Hecate) acoplado a um ligante que se liga a heptapéptido a membrana de superfície de protozoários no intestino do cupim subterrâneo Formosan. Essas técnicas incluem a extirpação do intestino de cupins trabalhadores, a cultura anaeróbica de intestino protozoários (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), a confirmação microscópica que o ligante marcadas com um corante fluorescente se liga ao intestino de cupins protozoários e outros protozoários de vida livre, mas não a bactérias ou tecido do intestino. Nós também demonstramos que o ligante mesmo acoplado a um peptídeo lítico eficiente mata intestino de cupins protozoários in vitro (cultura de protozoários) e in vivo (microinjeção no intestino posterior dos trabalhadores), mas é menos do que o bactericida peptídeo lítico sozinho. A perda de protozoários leva à morte dos cupins em menos de duas semanas.
No futuro, iremos modificar geneticamente microorganismos que podem sobreviver no intestino posterior de cupins e espalhar através de uma colônia de cupins como "Cavalos de Tróia" para expressar-ligante líticas peptídeos que mataria o protozoário no intestino de cupins e, posteriormente, matar os cupins na colônia . Ligante-lítica peptídeos também podem ser úteis para o desenvolvimento de medicamentos contra parasitas protozoários.
Protocol
Discussion
Ligante-lítica de peptídeos têm sido usados com sucesso para efetivamente atacar e destruir as células cancerosas (Hansel e Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Com base neste conceito, foi desenvolvido um ligante heptapéptido que se liga à superfície de protozoários no intestino de cupins subterrâneos Formosan e acoplado a um peptídeo lítico com o objetivo de destruir estes obrigam-celulose digerir simbiontes no intestino de cupins para alcançar cupins controle (Husseneder e Collier 2009). </…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Allison Richard, ex-diretor da unidade peptídeo LSU para a síntese do ligante fluorescentes, o Centro de Pesquisa Interdisciplinaray Biotecnologia, UF para a síntese de peptídeos ligante-líticas, ea instalação de Microscópio Socolovsky para fornecer acesso a microscópios de fluorescência. O financiamento foi fornecido pelo Programa de Desenvolvimento SERDP exploratória (SEED) do Departamento de Defesa, Departamento de Energia e Agência de Proteção Ambiental, a Biotecnologia AgCenter Programa Equipe Interdisciplinar eo estado de Louisiana.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL-2 | ||
| EDANS | Novabiochem | |||
| Anaerobic glove box | Coy Laboratories, Inc. | Custom made | ||
| Intellus environmental controller | Percival | I36NL | ||
| PC-10 Glass micropipette puller | Narishige Scientific Instrument Lab | PC-10 | ||
| Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm) | Narishige Scientific Instrument Lab | GD-1 | ||
| Leitz micromanipulators | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | ||
| Microinjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | ||
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0005 | ||
| LEICA fluorescence imaging system | Leica | DMRxA2 | ||
| LEICA dissecting scope | Leica | MZ16 | ||
| LEICA microscope | Leica | DMLB | ||
| Olympus dissecting scope | Olympus | SZ61 |
Referências
- Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases. Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).
- Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. Paratransgenesis for termite control. Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).
- Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites. Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).
- Husseneder, C., Grace, J. K. Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).
- Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).
- Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera). Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).
- Leuschner, C., Hansel, W. Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments. Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).
- Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads. J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).
- Trager, W. The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa. Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).
