हम शुद्ध, उच्च मिलकर चूहे सेलुलर bioenergetics, biophysical माप, प्रोटिओमिक्स या mitochondrial डीएनए और lipids विश्लेषण कार्यात्मक या संरचनात्मक अध्ययन के लिए mitochondria दिल के अलगाव के लिए а प्रोटोकॉल का वर्णन.
सेलुलर एटीपी oxidative phosphorylation की प्रक्रिया में पीढ़ी में mitochondria के समारोह में व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है. पिछले कुछ दशकों के दौरान ऊर्जा की पीढ़ी की तुलना में अन्य mitochondria के कार्यों की हमारी समझ में उल्लेखनीय प्रगति की गई है. ये apoptosis में उनकी भूमिका में शामिल हैं, organelles, स्तनधारी विकास संकेतन और सेल चयापचय और सेल प्रसार के बीच समन्वय के लिए उनके योगदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उम्र बढ़ने के रूप में अभिनय. Mitochondria द्वारा संग्राहक जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ अलगाव और प्रयोगशाला पशुओं के ऊतकों से बरकरार mitochondria की हैंडलिंग के लिए मजबूत तरीके पर आधारित है. चूहे दिल से Mitochondria बाहर दस्तक जानवरों पर अध्ययन सहित सेलुलर चयापचय के अतीत और वर्तमान के अध्ययन के लिए सबसे आम की तैयारी की है.
यहाँ हम युग्मन के एक उच्च डिग्री के साथ बरकरार mitochondria की अलगाव के लिए एक विस्तृत तेजी से विधि का वर्णन करता है. चूहे mitochondria दिल की इस तरह की तैयारी सेलुलर bioenergetics, biomolecules, प्रोटिओमिक अध्ययन mitochondrial डीएनए, प्रोटीन और lipids और विश्लेषण के परिवहन पर कार्यात्मक और संरचनात्मक अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट वस्तु है.
युग्मन के एक उच्च डिग्री के साथ बरकरार mitochondria के अलगाव के लिए विस्तृत तेजी प्रोटोकॉल में वर्णित है. प्राप्त तैयारी सेलुलर bioenergetics, प्रोटिओमिक अध्ययन या mitochondrial डीएनए और लिपिड सामग्री का विश्लेषण कार्यात्मक या संरचनात्मक अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आयनों और चयापचय मध्यवर्ती की सक्रिय परिवहन के biophysical का अध्ययन भी किया जा सकता है. यह संभव है करने के लिए आगे mitochondrial तैयार करने की प्रक्रिया के क्रम में submitochondrial कण, बाहरी झिल्ली या oxidative phosphorylation के शुद्ध अलग घटकों को अलग. वर्णित विधि Jacobus और एक Saks द्वारा अलगाव की मानक प्रोटोकॉल का एक संशोधन है. तैयार mitochondria की उम्मीद की उपज दिल प्रति mitochondrial प्रोटीन और Malate / ग्लूटामेट ऐसी तैयारी के बीच बदलता है पर सांस नियंत्रण अनुपात लगभग 10-15 मिलीग्राम है 8 से 12 μmol हे 0.12 के आसपास 2 xmin -1 xmg प्रोटीन के राज्य चतुर्थ श्वसन के साथ -1 23 ° सी 0.25 एम sucrose, 10 मिमी KCl, 0.2 मिमी EDTA, दीक्षा राज्य III श्वसन के लिए 150 सुक्ष्ममापी ADP (सटीक प्रयोगात्मक शर्तों और परिवर्धन के लिए, रेफरी देख के साथ 5 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट (पीएच 8.0) शामिल मध्यम में 2.).
विशेष ध्यान अलगाव प्रक्रिया के शुरू करने से पहले कई तकनीकी जानकारी दी जानी चाहिए. यह साफ polycarbonate या polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूबों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए ट्यूब अच्छी तरह से एक साफ ब्रश और गर्म पानी, लेकिन डिटर्जेंट उपचार न्यूनतम पर रखा जाना चाहिए के साथ धोया जाना चाहिए. इसके अलावा, यह बेहतर है ठंडे कमरे में सभी आवश्यक कांच के बने पदार्थ और उपकरणों के अलगाव के एक दिन पहले एकत्र.
अलगाव के दौरान जब बोतल से beakers के लिए स्थानांतरित बफ़र्स, а विशेष ध्यान के समाधान में बर्फ के पानी की बूंदों को रोकने के लिए दिया जाना चाहिए. जब ऊतकों से निपटने यह जोर दिया जाना चाहिए कि दिल निष्कर्षण बाहर किया जाना चाहिए भी जानवर के कत्ल और ठंडा ऊतक के बीच कम समय देरी आंशिक रूप से uncoupled mitochondria में नतीजा होगा के बाद से जितनी जल्दी हो सके. रैपिड ठंडा और हटाया दिलों की पूरी तरह से धोने के लिए मानक तैयारी, हीमोग्लोबिन और एरिथ्रोसाइट NADase से मुक्त प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
Trypsin संयोजी प्रोटीन गिरावट के लिए प्रयोग किया जाता है कर्तन बल एकरूपता दौरान ऊतक की संवेदनशीलता में वृद्धि. ऊतक के लम्बे समय तक protease के लिए जोखिम के बाद से यह निम्न गुणवत्ता के mitochondria में परिणाम से बचा जाना चाहिए.
अपकेंद्रित्र ट्यूबों के उच्च गति centrifugations के बाद दीवारों टिशू पेपर के साथ नष्ट किया जाना चाहिए दीवारों पर जमा वसा सामग्री के किसी भी जमा हटा.
अंतिम resuspension के लिए यह करने के क्रम में अंतिम बफर के एक कम मात्रा का उपयोग भंडारण (दिल प्रति बफर के 150 से 200 μl) के दौरान mitochondrial कार्यों की हानि को कम से कम बेहतर है. द्विसंयोजक फैटायनों के परिवहन के अध्ययन के लिए कोई chelating एजेंट अंतिम तैयारी इस तरह के mitochondria में कई बार के लिए उपस्थित होना EGTA मुक्त मध्यम के साथ धोया जाना चाहिए और अलगाव के बाद पहली घंटे के भीतर इस्तेमाल होना चाहिए.
The authors have nothing to disclose.
हम लेखकों के परिचय के लिए mitochondrial जीव विज्ञान और इस प्रक्रिया में कई उपयोगी अंतर्दृष्टि और सलाह के क्षेत्र में प्रो ए Vinogradov और डॉ. वेरा Grivennikova धन्यवाद. लेखकों वीडियो तैयारी के साथ मदद के लिए क्वींस विश्वविद्यालय के मीडिया कार्यालय से श्रीमती अमांडा McKintock के लिए आभारी हैं.