이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가
Summary
DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 대한 응답으로 빼앗아 – 139에서 H2AX의 인산화 다음 양식 γH2AX foci,의 현미경 분석 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기서 우리는 핵 내에서 방사선 유발 γH2AX 형성의 공간적 분포를 평가하기 위해 적극적으로 속기 euchromatin의 epigenetic 마커로 라이신 4 모노 – methylated 히스톤 H3에 항체를 사용합니다.
Abstract
DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)에 초기 분자 응답은 히스톤 H2AX 1,2의 터미널 SQEY의 모티브 내에서 빼앗아 – 139 잔기의 인산화입니다. H2AX 이러한 인산화은 phosphatidyl – inosito 3 키나제 (PI3K) 단백질의 가족 운동 실조증 telangiectasia 변이된 (ATM), DNA – 단백질 키나제 촉매 subunit와 ATM과 RAD3 관련 (ATR) 3 중재입니다. γH2AX이라고 H2AX의 phosphorylated 양식, immunofluorecence 현미경 3 쉽게 시각 아르 이산 foci를 형성 DSB의 사이트에서 염색질의 인접 지역으로 확산됩니다. γH2AX foci의 분석 및 quantitation 널리 특히 이온화 방사선에 대한 응답과 화합물 및 세포 독성 화합물 4를 수정 각종 방사선의 효능을 평가 DSB 형성 및 수리를 평가하는 데 사용되었습니다.
DSBs이 드 노보 마커의 절묘한 특이성과 감도 감안할 때, 그것은 염색질의 맥락에서 DNA 손상과 복구의 프로세스에 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다. 예를 들어, 방사선 생물학의 중심 패러다임은 핵 DNA가 방사선 민감도와 관련하여 중요한 목표는 것입니다. 사실, 현장에서 일반적인 합의는 크게 DNA 손상 및 수리를위한 단일 템플릿으로 염색질을 볼 수있다. 그러나, DSBs의 분자 마커, euchromatin과 heterochromatin의 γ – 방사선 유발 γH2AX foci 형성의 차이로 γH2AX의 사용과 5-7 관찰되었습니다. 최근, 우리는 항체의 패널을 사용하거나 모노, 제정 heterochromatin 및 transcriptional 입을와 라이신 4 epigenetic 인쇄물 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 아르 디 또는 리신 9 트라이 – methylated 히스톤 H3 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) ), 단단히 이온화 방사선 8 다음 γH2AX의 공간적 분포를 조사하기 위해 적극적으로 euchromatic 지역을 해독하는 상호. 염색질 생물학에 관한 일반적인 아이디어에 따라, 우리의 연구 결과는 γH2AX 형성과 적극적인 전사 구 사이에 밀접한 상관 관계를 지적했다. 여기는 다른 epigenetic 마커, 이미지 분석 및 3D 모델링과 함께 공동 지방화에 특히 초점, 비 점착 성의 세포에 γH2AX foci의 감지 및 quantitation위한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.
Protocol
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. 이 작품은 바이오 메디컬 이미징 개발 (주)에 대한 CRC에 의해 투자 설립과 호주 정부의 협동 연구 센터 (CRC) 프로그램에 따라 지원됩니다. LM은 멜버른 연구 (멜버른 대학)와 바이오 메디컬 이미징 CRC의 보조 장학금으로 지원됩니다. 모나 마이크로 이미징의 지원 (DRS 스티븐 코디 Iśka 카마 이클)이 작품 소중한했다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
| Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
| Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
| Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referências
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- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
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