El análisis microscópico de γH2AX focos, que forman después de la fosforilación de H2AX en la Ser-139 en respuesta a ADN de doble filamento se rompe, se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí hemos utilizado un anticuerpo mono-metílico de la histona H3 lisina 4 como marcador epigenético de la eucromatina activa la transcripción, para evaluar la distribución espacial de la radiación inducida por la formación de γH2AX dentro del núcleo.
Una primera respuesta molecular a roturas en el ADN de doble cadena (DSB) es la fosforilación de la Ser-139 de residuos en el motivo SQEY terminal de la histona H2AX 1,2. Esta fosforilación de H2AX está mediada por la fosfatidil-inosito 3-quinasa (PI3K), la familia de las proteínas, la ataxia telangiectasia mutada (ATM), el ADN-proteína de la subunidad catalítica y la quinasa ATM y RAD3 relacionadas con 3 (ATR). La forma fosforilada de H2AX, conocido como γH2AX, se extiende a las regiones adyacentes de la cromatina en el sitio del OSD, la formación de focos discretos, que son fácilmente visualizados por microscopía immunofluorecence 3. Análisis y cuantificación de γH2AX focos ha sido ampliamente utilizada para evaluar la formación de OSD y la reparación, en particular en respuesta a la radiación ionizante y para la evaluación de la eficacia de la radiación y varios compuestos de la modificación de los compuestos citotóxicos 4.
Dada la especificidad y la sensibilidad exquisita de este marcador de novo de DSBs, ha proporcionado nuevos conocimientos sobre los procesos de daño y reparación del ADN en el contexto de la cromatina. Por ejemplo, en biología de la radiación del paradigma central es que el ADN nuclear es el objetivo fundamental con respecto a la sensibilidad a la radiación. De hecho, el consenso general en el campo ha sido en gran parte para ver la cromatina como un modelo homogéneo de los daños y reparación del ADN. Sin embargo, con el uso de γH2AX como marcador molecular de DSBs, una disparidad en γ-inducida por irradiación formación γH2AX focos en la eucromatina y heterocromatina se ha observado 5-7. Recientemente, hemos utilizado un panel de anticuerpos para cualquier mono-, di-o tri-metilación de histonas H3 en la lisina 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) que se imprime epigenética de la heterocromatina constitutiva y silenciamiento transcripcional y la lisina 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), que están estrechamente correlacionados activa la transcripción de las regiones eucromática, para investigar la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes 8. De acuerdo con las ideas dominantes sobre la biología de la cromatina, nuestros resultados indican una estrecha correlación entre la formación de γH2AX y activa la transcripción 9. Aquí demostramos nuestro método de inmunofluorescencia para la detección y cuantificación de γH2AX focos en las células no adherentes, con especial hincapié en la co-localización con otros marcadores epigenéticos, análisis de imágenes y modelos 3D.
The authors have nothing to disclose.
El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). Este trabajo está financiado por el CRC de Imágenes Biomédicas Development Ltd, establecido y apoyado en los Centros del Gobierno de Australia s de Investigación Cooperativa (CRC). LM con el apoyo de Melbourne de Investigación (Universidad de Melbourne) y de Imágenes Biomédicas becas complementarias CRC. El apoyo de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody y Carmichael Iska) fue muy valiosa para este trabajo.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |