Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз

Summary

В этом видео мы продемонстрируем, как изолировать сетчатки стволовых клеток из ресничного эпителия мыши глаз и вырастить их в культуру в форме клональной сетчатки сферах. Сферах, которые изолированы обладают кардинальные свойства стволовых клеток: самообновлению и multipotentiality.

Abstract

Взрослых мышей стволовые клетки сетчатки (РКК) является редким покоя клетка найти в ресничного эпителия (CE) из глаза у млекопитающих ^1,2,3. CE состоит из непигментированной внутренних и внешних слоев пигментированные клетки, и клональной РКК колоний, которые вытекают из одного пигментированные клетки от CE состоят как пигментированные и не пигментированные клетки, которые могут быть дифференцированы по форме все типы клеток нервной сетчатки и ПЭС. Существует некоторая полемика о том, все клетки в сферах содержат по крайней мере некоторые пигмента ^4, однако клетки все еще ​​способны образовывать различные типы клеток найдены в нейронных сетчатки ^1-3. У некоторых видов, например, земноводных и рыб, их глаза способны к регенерации после травмы ^5, однако, глаза у млекопитающих не показывает таких регенеративные свойства. Мы стремимся к выявлению стволовых клеток в естественных условиях и понять механизмы, которые держат млекопитающих сетчатки стволовыми клетками покоя ^6-8, даже после травмы, а также использовать их как потенциальный источник клеток, чтобы помочь восстановить физические или генетические модели повреждения глаз путем трансплантации ^9-12. Здесь мы опишем, как изолировать цилиарной эпителиальные клетки мыши глаз и вырастить их в культуру, чтобы сформировать клональной сетчатки сферах стволовых клеток. С Есть не известные маркеры стволовых клеток в живом организме, эти сферы являются единственным известным способом перспективно выявление населения стволовых клеток в ресничного эпителия глаза.

Protocol

1. Подготовка Пройдя Решения и ферментов Решения Сделать искусственное спинно-мозговой жидкости (ACSF) и сыворотки среде заранее и поставить в холодильник. Отвешивать кинуреновой кислота (0,2 мг / мл) и растворяют в 10 мл Хило ACSF в 37 ° С водяной бане заранее, поскольку она не растворяются. Отвешивать трипсина (1,33 мг / мл) и гиалуронидазы (0,67 мг / мл) и место в одном 15 мл трубку и держать его при температуре -20 ° C до необходимости. Добавить кинуреновой раствора кислоты на эту трубу и фильтр, используя шприц 22 мкм фильтр непосредственно перед использованием. Отвешивать ингибитор трипсина (Ovamucoid: 1 мг / мл) и растворяют в теплой сыворотки среде и фильтр, используя 22μm фильтр шприца. Сделать покрытие СМИ: сыворотки среде содержащей FGF2 (10 нг / мл) и гепарин (2 мкг / мл). 2. Изоляция стволовых клеток сетчатки от мыши глаз Выделение стволовых клеток сетчатки выполняется в конкретных стерильной комната, посвященная первичных экспериментов культуры. Перед началом этой процедуры, создать микроскоп и рассекает холодный источник света, а затем выложить стерильной рассекающих инструментов. Каждый вытяжки горячего бусинка стерилизатор для стерилизации инструментов между шагами. Мы будем изолировать стволовые клетки сетчатки от глаз, которые были размещены непосредственно в стерильную чашку Петри, содержащих искусственные спинно-мозговой жидкости (ACSF) после их удаления из мышей, забитых в соответствии с утвержденными животных этики протоколов. Под микроскопом рассекает, чистые глаза щипцами: избавиться от волос и соединительной ткани, которая крепится к роговицы / склеры границы. Затем перенесите глаза на новое блюдо с ACSF. Хотя нежно держа глаз стационарных щипцами зубчатые, использовать угловые микро-рассечение ножницами для удаления глазных мышц. Удалить зрительного нерва, а если он еще привязаны к глазу. Постарайтесь не хлюпать глаз во время этого процесса. Передача глаза на новое блюдо с ACSF. Следующая использовать изогнутые микро-рассечение ножницами резать глаз пополам: начинаются в зрительный нерв и прорезать середину роговицы, встреча назад на зрительный нерв, где сокращение было начато. Это идеальное место, если две части глаза являются примерно такими же размерами, потому что это сделает следующий шаг легче. Холдинг роговицы с помощью двух пинцетом, осторожно очистите глаза две половины друг от друга. Выньте и выбросьте линзы, внутренних органов и нервной сетчатки глаза от снарядов. Передача снаряды новое блюдо с ACSF. Теперь мы готовы выделить ресничного эпителия. Во-первых, ориентироваться глаз оболочку, так что роговица справа от вас и пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) находится на левой. Аккуратно контактный глаз оболочку вниз с прямыми щипцами на стороне ППД. Затем с помощью скальпеля, чтобы сократить роговицы и радужной оболочки глаза от ресничного эпителия глаза, осторожно нажимая на скальпель, а не использовать распиловки движений. После этого, вырезать реснитчатого эпителия от ППД. Использовать не зубчатые щипцы для передачи полосу реснитчатого эпителия в новый 35-мм блюдо с ACSF. Таким же образом, изолировать реснитчатого эпителия из другой оболочки глаза. Как только оба ресничного эпителия полосы были собраны, передача полос, на 35-мм блюдо, содержащий 2 мл Dispase. Место блюдо с полосами в 37 ° C инкубаторе в течение 10 минут. Через 10 минут, передача полосы от Dispase в чашку, содержащий 2 мл отфильтрованной трипсина, гиалуронидазы и кинуреновой кислоты. Место блюдо при температуре 37 ° С в течение 10 минут. Теперь вернемся к рассекает микроскопом. Удерживая склеры вниз с прямыми щипцами, используйте нижнюю часть изогнутой не-зубчатыми щипцами аккуратно очистить реснитчатого эпителия от склеры. Удалить из склеры блюдо. Все, что нужно оставить в блюдо теперь клетки интересов и раствора фермента. Использование огневой полировкой хлопка подключен пипетки, передачи этого решения в 14-мл трубки. Растирают это решение в 30 раз разбиваются на части эпителиальных клеток, мягко заставляя решение в и из пипетки. Центрифуга трубки в течение 5 минут при 1500 оборотов в минуту. При центрифугировании будет сделано, удалить трубку из центрифуги осторожно, поскольку клетки склонны к отрываясь дне пробирки на данном этапе. Аккуратно аспирата большинство супернатант использованием огневой полировкой пипетки, а затем добавьте 1 мл ингибитора трипсина в сыворотке свободного СМИ к клеткам. Используйте небольшие скважины хлопка подключен пипеткой измельченного в порошок образца примерно в 50 раз, пока не будет одного-клеточной суспензии. Центрифуга трубке снова в течение 5 минут при 1500 оборотов в минуту. Удалить супернатант и заменить его на 1 мл ваш покрытие среды. Измельченного в порошок мягко использованием пожарной полированное стекло пипетки для ресуспендирования клеток. После графаING клеток, их на пластины требуемой плотности в 24-луночного планшета. Мы обычно пластины 10 клеток / мкл, заполняя каждую лунку первым со средним и последующим добавлением суспензии клеток для получения конечного объема 500 мкл СМИ. Место пластины в 37 ° C CO 2 инкубаторе, где она не будет перенесена, пока вы рассчитываете сферах, которые возникают через 7 дней. 3. Результаты выделения стволовых клеток сетчатки Когда эта процедура выполнена успешно, расчлененный цилиарной эпителиальных клеток, должна выглядеть следующим образом после того, как диссоциированных и покрытие при низкой плотности (рис. 1). Через 7 дней в культуре, сетчатки стволовыми клетками сферах, которые возникают, подсчитываются. Сфере должно быть более 75 мкм в диаметре и свободно плавающего будет считаться стволовых клеток производных сфере. (Рис. 2). Тем не менее, некоторые клетки будут иметь ограниченный сфероидов распространения и формы, которые не соответствуют критерию размера и не будет считаться стволовых клеток производных сферах; примером такого сфероида показана здесь (рис. 2). 4. Представитель Результаты Рисунок 1. Рисунок 2.

Discussion

Этот протокол описывает, как изолировать сетчатки стволовых клеток из ресничного эпителия мыши глаз ^1-3. Методология выделения полос реснитчатого эпителия может меняться, однако ферменты и методологию для достижения одной клеточной суспензии были оптимизированы в этом протоколе. Важно также, что полосы реснитчатого эпителия, которые были изолированы не содержат большого количества НПП или роговицы, так как эти, как представляется, негативное влияние на общее число сфер, которые могут быть изолированы друг от друга глаз. Кроме того, сыворотки среде, что мы делаем, которая была первоначально разработана для мозга нейросферы ^13, идеально подходит для выращивания сетчатки сферах стволовых клеток. Следует также убедиться, что клетки не нарушается после того как они были покрыты и поместили в инкубатор, чтобы растущие сферы не совокупный вместе ^14.

После сетчатки стволовыми клетками сформировали клональной сферах, их можно пересчитать, чтобы получить перспективные количество стволовых клеток в глазу. Сферы, то может быть отделена в одиночных камерах и пассировать выяснить самообновлению возможности или дифференцировались в различные типы клеток нервной сетчатки и ПЭС, используя различные комбинации факторов роста и / или белков.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Stemi 2000 Microscope		Zeiss
Cold Light Source		Zeiss	KL1500	dual arm optic light
Curved Mini Vannas scissors		FST	15000-10
Angled Vannas scissors		FST	15005-08
#7 Dumont forceps		FST	11272-30	non-serrated
#5 Dumont forceps		FST	11251-10	straight
Fine forceps		FST	11051-10	serrated curved
#3 Scalpel handle		Almedic	2586-M36-10
#10 Scalpel blades		Almedic	2580-M90-10
Hot Bead Sterilizer		FST	18000-45
Dispase		VWR/BD	CACB354235
Trypsin		Sigma	T1005
Hyaluronidase		Sigma	H6254
Kynurenic Acid		Sigma	K3375	1000 IU
Trypsin Inhibitor		Roche	10109878001
35 mm dishes		VWR/Nunc	CA354235
24-well plate		VWR/Nunc	CA73521-004
Cotton-plugged pipettes		VWR	14672-400	fire-polish
14 mL Tubes		Falcon	352057	Polystyrene
Serum-free Media				Ref# 13 for formulation
FGF2		Sigma	F0291
Heparin		Sigma	H3149	100 IU