In deze video, zullen we laten zien hoe je netvlies stamcellen uit het ciliaire epitheel van de muis oog te isoleren en te groeien ze in cultuur tot klonale netvlies bollen te vormen. De bollen die zijn geïsoleerd beschikken over de kardinale eigenschappen van stamcellen: self-vernieuwing en multipotentiality.
De volwassen muis retinaal stamcellen (RSC) is een zeldzame rustende cel gevonden binnen de ciliaire epitheel (CE) van de zoogdieren oog 1,2,3. Het CE bestaat uit niet-gepigmenteerde binnen-en gepigmenteerde buitenste cellagen, en de klonale RSC kolonies die voortvloeien uit een enkele gepigmenteerde cel uit het CE zijn opgebouwd uit zowel gepigmenteerde en niet-gepigmenteerde cellen die kunnen worden gedifferentieerd om alle vormen celtypen van de neurale netvlies en de RPE. Er is enige controverse over de vraag of alle cellen in de sferen bevatten alle ten minste een aantal pigment 4, maar de cellen zijn nog in staat de vorming van de verschillende celtypes gevonden binnen de neurale netvlies 1-3. Bij sommige soorten, zoals amfibieën en vissen, hun ogen zijn in staat om de regeneratie na verwonding 5, echter, de zoogdieren oog vertoont geen regeneratieve eigenschappen. Wij streven ernaar om de stamcellen in vivo te identificeren en om de mechanismen die ervoor zorgen dat het zoogdier netvlies stamcellen rust 6-8 te begrijpen, zelfs nadat zowel de schade als het gebruik ervan als een potentiële bron van cellen te repareren fysieke of genetische modellen van de verwonding aan het oog te helpen door middel van transplantatie 9-12. Hier beschrijven we hoe u de ciliaire epitheel cellen van de muis oog te isoleren en te groeien ze in de cultuur om de klonale netvlies stamcellen bollen te vormen. Aangezien er geen bekende merkers van de stamcellen in vivo, deze gebieden zijn de enige bekende manier om de stamcellen bevolking prospectief identificeren op het ciliaire epitheel van het oog.
Dit protocol beschrijft hoe te isoleren van stamcellen uit het netvlies van de ciliaire epitheel van de muis oog 1-3. De methodologie voor het isoleren van de strips van ciliaire epitheel kan variëren, maar de enzymen en de methodologie voor het bereiken van een single-celsuspensie zijn geoptimaliseerd in dit protocol. Het is ook belangrijk dat de strips van de ciliaire epitheel die zijn geïsoleerd geen grote hoeveelheden van de RPE of hoornvlies bevatten omdat deze lijken een negatieve invloed op het totaal aantal bollen dat kan worden geïsoleerd van elk oog hebben. Daarnaast is de serum-vrije media die we maken die oorspronkelijk was ontwikkeld voor de hersenen neurospheres 13, is ideaal voor het verbouwen van het netvlies stamcellen bollen. Men moet er ook voor zorgen dat de cellen niet worden verstoord nadat ze zijn verguld en geplaatst in de couveuse, zodat de groeiende bollen niet samenklonteren 14.
Zodra het netvlies stamcellen hebben gevormd klonale bollen, kunnen ze worden gerekend tot een potentiële aantal stamcellen per oog te krijgen. De bollen kunnen dan vervolgens gescheiden worden in losse cellen en gepasseerd om na te gaan zelfvernieuwing mogelijkheden of gedifferentieerd in de verschillende celtypen van de neurale netvlies en RPE het gebruik van verschillende combinaties van groeifactoren en / of eiwitten.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Laura Clarke voor haar onschatbare hulp. Dit werk wordt ondersteund door NCE: Stem Cell Network, CIHR en NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |