原代细胞培养从果蝇原肠胚
Summary
我们提供一份详细的协议，准备原代细胞脱离<em> Drosophil</em>一个胚胎。能够进行有效的RNAi扰动，与其他分子生物学，生物化学和细胞成像方法，将允许各种问题加以解决，<em>果蝇</em>原代细胞。
Abstract
在这里，我们描述了一个准备从果蝇原肠期胚胎和培养原代细胞分离的方法。总之，大量上演来自年轻和健康的苍蝇的胚胎收集，消毒，然后身体成单细胞悬浮液，使用玻璃匀浆分离。镀合适的密度，在培养基中培养板或玻片上后，这些细胞可以进一步分化成几种形态不同的细胞类型，可以通过其特定的细胞标记鉴定。此外，我们目前的治疗与双链（DS）的RNA这些细胞，引起基因敲除的条件。在果蝇中的主要细胞的高效RNAi是通过简单地沐浴在培养基中含有双链RNA的细胞。开展有效的RNAi的扰动，与其他分子生物学，生物化学，细胞成像分析的能力，将允许在果蝇的主要细胞，尤其是那些涉及到分化的肌肉和神经细胞的回答各种各样的问题。
Protocol
1。准备蝇笼生长在方便的容器，如32盎司昆虫杯果蝇（野生型菌株，如俄勒冈- R或任何基因型）。 新eclosed苍蝇大的胚胎回收笼，或飞人口笼。 一个房间移动到笼子里的温度〜25 ° C，湿度〜65％在12小时轻和黑暗的12小时周期，以方便收集同步胚胎。 维持在笼子里的苍蝇喂养它们杀死酵母膏挑染糖蜜板。糖蜜板（死亡人数酵母膏）为2-3天更换一次D. <p class…
Discussion
果蝇细胞的原代培养的发展模式可以相差很大，可能是由于在主细胞制备过程中的几个变量。首先，苍蝇产卵应该是年轻的（在一个星期内老）和健康（无病毒或细菌感染）。未受精或受感染的胚胎必须避免，因为他们是无用的，从这些胚胎来源的细胞不能区分，将只能存活1-2天。其次，在同质化过程中，重要的是不超载太多的胚胎匀浆。匀浆超载太多的胚胎，会导致碎片和死细胞，最终…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
巴顿得到了达蒙Runyon癌症研究基金会奖学金DRG – 1716 – 02。锦州是支持由美国国立卫生研究院/ NIGMS奖学金F32 GM082174 – 02。 NP是霍华德休斯医学研究所研究员。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S3652 | ||
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | ||
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I-6634 | ||
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | ||
| #25 US standard testing sieve | VWR | 57334-454 | ||
| #45 US standard testing sieve | VWR | 57334-462 | ||
| #120 US standard testing sieve | VWR | 57334-474 | ||
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR | 62400-620 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0040 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0100 | ||
| Costar, 384-well plate | VWR | 29444-078 | ||
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
Referências
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- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
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Citar este artigo
Perrimon, N., Zirin, J., Bai, J. Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos. J. Vis. Exp. (48), e2215, doi:10.3791/2215 (2011).