Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

Resumo

Este protocolo descreve um método não-viral de entrega de construções genéticas para uma determinada área do cérebro de roedores vivos. O método consiste na preparação de plasmídios, fabricação micropipeta, a cirurgia de rato neonatal filhote, microinjeção da construção, e In vivo Eletroporação.

Resumo

Criação de animais transgênicos é uma abordagem padrão no estudo de funções de um gene de interesse in vivo. No entanto, muitos knockout ou animais transgênicos não são viáveis ​​nos casos em que o gene modificado ou excluído é expressa em todo o organismo. Além disso, uma variedade de mecanismos compensatórios, muitas vezes dificultam a interpretação dos resultados. Os efeitos compensatórios podem ser atenuadas por qualquer tempo a expressão de genes ou limitar a quantidade de células transfectadas.

O método de microinjeção ventricular não-pós-natal e no eletroporação in vivo permite entrega prevista para genes, moléculas de corante siRNA ou diretamente a uma pequena região de interesse no cérebro de roedores recém-nascidos. Em contraste com a técnica convencional de injeção ventricular, este método permite a transfecção de tipos de células não-migratórias. Transfectadas animais por meio do método descrito aqui pode ser usado, por exemplo, por dois fótons de imagem in vivo ou em experimentos eletrofisiológicos em fatias cerebral aguda.

Protocolo

1. Introdução

Criação de animais transgênicos é um poderoso método de investigação das funções dos genes em animais vivos e ^um mecanismo para desvendar a doença ^2,3, bem como para manipular propriedades de células ^4. No entanto, o procedimento é bastante trabalhoso, extremamente moroso e caro, portanto, que fundamentam a utilização de métodos alternativos de entrega gene como a injeção viral ^5, injeção ventricular neonatal com ⁶ e eletroporação in utero eletroporação ^7,8. O método de injeção ventricular não-pós-natal e eletroporação tem um conjunto exclusivo de vanta....

Discussão

Métodos de entrega de gene no cérebro de roedores vivos estão bem estabelecidos no utero eletroporação ^7,8,11,12 e, mais recentemente, por eletroporação pós-natal ^6. No entanto, esses métodos são baseados em injeção intraventricular do DNA plasmídeo, que pode ser limitante para diversas aplicações. Por exemplo, estes métodos não permitem a segmentação células em certas áreas do cérebro, como hipocampo, nem a transfecção de tais tipos de células não-migratórias como astrócitos corticais. Ve.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça 2A-sa, 115 mm	equipamento	XYtronic	XY-2A-SA	Trate com etanol 70% para desinfecção antes do uso em manipulações cirúrgicas
Controlador de Temperatura Biológico com almofada de aquecimento de aço inoxidável	equipamento	Supertech	TMP-5b
Tubo de borossilicato com filamento	material	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10	Agulha de vidro
Brocas descartáveis	material	Meisinger	HP 310 104 001 001 008
Dulbecco’s PBS 10X	reagente	Sigma-Aldrich	D1408
Pinça Dumont #5, 110 mm	equipamento	Fine Science Tools	91150-20	Tratar com etanol 70% para desinfecção antes do uso em manipulações cirúrgicas
Ealing micr–puxador de eletrodos	equipamento	Ealing	50-2013	Puxador de vidro para eletrodos verticais
Ethilon poliamida monofilamento 6-0 FS-3 16 mm 3/8c	material	Johnson && Johnson	EH7177H	Fios cirúrgicos
Seringa micro Exmire 10,0 ml	equipamento	Exmire	MS*GLLX00	Seringa hermética a gás
Verde Rápido	reagente	Sigma-Aldrich	F7252
Eletrodos de pinça	equipamento	BEX	LF650P3	Trate com etanol 70% para desinfecção antes do uso
Controle de broca Foredom	equipamento	Foredom	FM3545	Fonte de alimentação e controle do torno cirúrgico. O equipamento análogo atualmente disponível é o kit de micromotor K.1070 (Foredom)
Peça de mão com motor micro Foredom	equipamento	Foredom	MH-145	O kit de micromotor analógico atualmente disponível é o K.1070 (Foredom)
Plataforma de anestesia gasosa para camundongos	equipamento	Stoelting Co.	50264	Montado no aparelho estereotáxico
Isoflurano	reagente	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Pinça microcirúrgica, 105 mm	equipamento	Aesculap	BD302R	Trate com etanol 70% para desinfecção antes do uso em manipulações cirúrgicas
Microfil	material	World Precision Instruments, Inc.	MF34G-5	Capilares para preenchimento de seringas micro
Óleo mineral	reagente	Sigma-Aldrich	M8410
NanoFil Seringa 10 microlitros	equipamento	World Precision Instruments, Inc.	NANOFIL	seringa de Hamilton
plasmídeo CAG-EGFP	reagente			Extraído e purificado com o EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) e dissolvido em água livre de nucleases até a concentração de 1,5 mg/ml
Gerador de pulsos CUY21Vivo-SQ	equipamento	BEX	CUY21Vivo-SQ
gel para eletrodo Schiller	reagente	Schiller AG	2.158000	Gel condutor
Instrumento estereotáxico para pequenos animais	equipamento	David Kopf Instruments	900
St–Adaptador para camundongo e rato neonatal	equipamento	Stoelting Co.	51625	Montado no aparelho estereotáxico. Tratar os pinos auriculares com etanol 70% para desinfecção antes do uso em manipulações cirúrgicas
Tesoura de íris para estudante, reta 11,5 cm	equipamento	Fine Science Tools	91460-11	Trate com etanol 70% para desinfecção antes do uso em manipulações cirúrgicas
Sugi swabs absorventes 17 x 8 mm	material	Kettenbach	31602	Tampões cirúrgicos
Bomba de microseringa UMP3 e controlador de bomba de microseringa Micro 4	equipamento	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1	Microinjetor e controlador
Univentor 400 Unidade de Anestesia	equipamento	Univentor	8323001