Методы экспериментальных манипуляций после оптические Перерезка нерва в ЦНС млекопитающих
Summary
Оптические перерезки нерва широко используется модель взрослого травмы ЦНС. Эта модель идеально подходит для проведения ряда экспериментальных манипуляций, нацеленных сетчатки глобально или непосредственно целевой ранения нейронов населения ганглиозных клеток сетчатки.
Abstract
Ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в ЦНС нейроны, которые выводят визуальную информацию от сетчатки в мозг через зрительный нерв. Зрительного нерва могут быть доступны в орбите глаза и полностью перерезана (axotomized), резки аксоны весь РГК населения. Оптические перерезки нерва воспроизводимые модели апоптоза нейронов гибель клеток во взрослом ЦНС 1-4. Эта модель особенно привлекательна тем, стекловидное камеры глаза действует как капсулы для доставки лекарств к сетчатке, что позволяет с помощью экспериментальных манипуляций внутриглазных инъекций. Диффузии химических веществ через стекловидное жидкости гарантирует, что они действуют на весь РГК населения. Вирусные векторы, плазмиды или короткий вмешательства РНК (siRNAs) также могут быть доставлены в стекловидной камере для того, чтобы заразить или трансфекции клеток сетчатки 5-12. Высокий тропизм адено-ассоциированные вирус (AAV) векторов выгодно для целевой РГК, с инфекцией ставка приближается к 90% клеток вблизи места инъекции 6, 7, 13-15. Более того, РГК могут быть выборочно трансфекции с применением siRNAs, плазмиды или вирусные векторы, чтобы сократить конце зрительного нерва 16-19 или инъекционные векторы в своей целевой верхний бугорок 10. Это позволяет исследователям изучать механизмы апоптоза в поврежденных нейронов населения, не смешивая воздействия на другие нейроны свидетеля или окружающей глии. RGC апоптоз имеет характерное время курс которой гибель клеток задерживается 3-4 postaxotomy дней, после чего клетки быстро вырождается. Это обеспечивает окно для экспериментальной манипуляции направлены против путей, участвующих в апоптозе. Манипуляции, которые нацелены непосредственно на РГК из перерезанного оптических культи нерва выполняются во время axotomy, сразу же после резки нерва. Напротив, когда вещества доставляются внутриглазного маршрута, они могут быть введены до операции или в течение первых 3 дней после операции, предшествующие началу апоптоза в axotomized РГК. В настоящей статье мы покажем несколько методов для экспериментальных манипуляций после перерезки оптический нерв.
Protocol
Discussion
Оптические перерезки нерва высокой воспроизводимостью модель взрослого апоптоза нейронов ЦНС. Экспериментальных манипуляций продемонстрировали в этой рукописи позволяют изучить механизмы апоптоза РГК после травмы.
Внутриглазное инъекции полезны для глобальной ори…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PDK поддерживается операционной CIHR гранта (СС 86523)
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stereotaxic Frame | Stoelting, Kopf, WPI | |||
| Rat Gas Mask | Stoelting, Kopf, WPI | |||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | ||
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Corp | DIN 02225875 | ||
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | |||
| Alcaine Eye Drops | Alcon | |||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | |||
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | ||
| 10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2) | Hamilton Syringe Co. | 80030 | ||
| 1/16 inch Compression Fittings | Hamilton Syringe Co. | 55751-01 | ||
| 1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing | Supelco, Bellefonte, PA | Z226661 | ||
| Dual RN Glass Coupler | Hamilton Syringe Co. | 55752-01 | ||
| Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa | Hamilton Syringe Co. | PRMKIT |
Referências
- Bahr, M. Live or let die – retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
- Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system – molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
- Arai-Gaun, S. Heme oxygenase-1 induced in muller cells plays a protective role in retinal ischemia-reperfusion injury in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 4226-4232 (2004).
- Bainbridge, J. W., Tan, M. H., Ali, R. R. Gene therapy progress and prospects: the eye. Gene Ther. 13, 1191-1197 (2006).
- Polo, A. D. i. Prolonged delivery of brain-derived neurotrophic factor by adenovirus-infected Muller cells temporarily rescues injured retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 3978-3983 (1998).
- Herard, A. S. siRNA targeted against amyloid precursor protein impairs synaptic activity in vivo. Neurobiol Aging. 27, 1740-1750 (2006).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. The upregulation of GLAST-1 is an indirect antiapoptotic mechanism of GDNF and neurturin in the adult CNS. Cell Death Differ. 15, 471-483 (2008).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neurociência. 125, 903-920 (2004).
- Naik, R., Mukhopadhyay, A., Ganguli, M. Gene delivery to the retina: focus on non-viral approaches. Drug Discov Today. 14, 306-315 (2009).
- van Adel, B. A. Delivery of ciliary neurotrophic factor via lentiviral-mediated transfer protects axotomized retinal ganglion cells for an extended period of time. Hum Gene Ther. 14, 103-115 (2003).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Allocca, M. AAV-mediated gene transfer for retinal diseases. Expert Opin Biol Ther. 6, 1279-1294 (2006).
- Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Res. 48, 353-359 (2008).
- Garcia-Valenzuela, E. Axon-mediated gene transfer of retinal ganglion cells in vivo. J Neurobiol. 32, 111-122 (1997).
- Koeberle, P. D., Wang, Y., Schlichter, L. C. Kv1.1 and Kv1.3 channels contribute to the degeneration of retinal ganglion cells after optic nerve transection in vivo. Cell Death Differ. 17, 134-144 (2010).
- Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
- Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
- Leon, S. Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve. J Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).
- Mansour-Robaey, S. Effects of ocular injury and administration of brain-derived neurotrophic factor on survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 1632-1636 (1994).
- D’Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult. J Vis Exp. , .
