قياس الوصلات العصبية : حدث الفحص كيمياء سيتولوجية مناعية القائم على القياس الكمي للعدد سنبس
Summary
هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تحديد عدد المشبك في كل ثقافة العصبية وفصلها في أقسام المخ باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية. المقصورة الخاصة به الأضداد ، ونحن تسمية محطات قبل المشبكي وكذلك المواقع ذات التخصص بعد المشبكي. نحدد نقاط الاشتباك العصبي كنقاط colocalization بين الإشارات التي تولدها هذه العلامات.
Abstract
واحدة من أهم الأهداف في علم الأعصاب هو فهم الاشارات الجزيئية التي توعز المراحل الأولى من تشكيل المشبك. على هذا النحو أصبح من الضروري وضع نهج موضوعي لقياس التغييرات في اتصال متشابك. بدءا من تثبيت العينة ، وهذا البروتوكول تفاصيل كيفية تحديد عدد المشبك في كل ثقافة العصبية وفصلها في أقسام المخ باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية. المقصورة الخاصة به الأضداد ، ونحن تسمية محطات قبل المشبكي وكذلك المواقع ذات التخصص بعد المشبكي. نحدد نقاط الاشتباك العصبي كنقاط colocalization بين الإشارات التي تولدها هذه العلامات. وكميا في عدد من هذه colocalizations باستخدام المكونات في محلل نقاط و(كتبه ارك البارى ، متوفرة عند الطلب ، c.eroglu @ cellbio.duke.edu) في إطار برنامج ImageJ منصة التحليل. يمكن تطبيق مقايسة المشبك وصفها في هذا البروتوكول إلى أي تحضير الأنسجة العصبية أو الثقافة التي لديك علامات انتقائية قبل وبعد المشبكي. هذا الاختبار المشبك هو أداة قيمة التي يمكن استخدامها على نطاق واسع في دراسة التنمية متشابك.
Protocol
Discussion
يستند مقايسة المشبك المذكورة أعلاه في سياق أهدافنا التجريبية ، حيث نركز بشكل كبير على توقعات مثير للRGCs ، سواء في الثقافة أو المنقى في القسم الدماغ. لقد قدمنا قائمة الأضداد مرجع الجدول الذي تعمل بشكل جيد لوضع العلامات نقاط الاشتباك العصبي مثير (الجدول 1).
<p class="jove_…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
في مختبر بن ألف Barres (جامعة ستانفورد) : نقاط والمكونات في صورة كانت مكتوبة من قبل J ارك باري (استشارات Physion العنوان الحالي) محلل
التمويل ؛
- ألفريد سلون مؤسسة P.
- ألف لاستير وجوزيف Klingenstein الصندوق ، وشركة
- مؤسسة بحوث الطبية الحيوية واسعة
- علاج لمرض هنتنغتون مبادرة ليالي
Materials
| Antigen | Species | Monoclonal/Polyclonal | Vendor | Catalog Number | Dilution | Works in Culture | Works in Sections | |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 106004 | 1:750 | Y | N.D. |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 106001 | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs | VAM-PS003F | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems | 141004 | 1:1000 | Y | N.D. | |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 105002 | 1:750 | Y | N | |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 104211 | 1:500 | Y | Y | |
| Synaptophysin (C1.7.2) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 101011 | 1:500 | Y | Y | |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore | MAB5502 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB5905 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB2251 | 1:2500 | N | Y | |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) |
Mouse | Monoclonal | Affinity Bio Reagents | MA1-045 | 1:750 | Y | N |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed | 51-6900 | 1:500 | N | Y | |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 160011 | 1:500 | Y | N.D. | |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore | AB5875 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 147003 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 147 | 1:200 | Y | Y |
Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined.
| Reagent | Company | Cat. No. |
| PBS | Invitrogen | 20012-027 |
| poly-d-lysine | Sigma | P6407 |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 |
| Normal Goat Serum | Gibco | 16210 |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher | BP152-5 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
| l-lysine | Sigma | L-1137 |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
| 24-well culture plate | Falcon | 35-3047 |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | — |
| Supply | Company | Cat. No. |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR Scientific | 48393241 |
| Glass slides | VWR Scientific | 48311-703 |
Referências
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 .
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse. J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).
- Schmidt, J. T. Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism. Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).
- Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons. J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).
- Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).
- Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis. Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).
