Кристаллизации белков для рентгеновской кристаллографии
Summary
3-D структура молекулы дает уникальное понимание того, как функции молекулы. Основным методом определения структуры в ближнем атомное разрешение рентгеновской кристаллографии. Здесь мы демонстрируем, современные методы получения трехмерных кристаллов любой макромолекулы, которые подходят для определения структуры методом рентгеновской кристаллографии.
Abstract
Использование трехмерной структуры биологических макромолекул сделать вывод, как они функционируют является одним из важнейших направлений современной биологии. Наличие атомных структур разрешение обеспечивает глубокое и уникальное понимание функции белка, и помогает раскрыть внутренние механизмы живой клетки. На сегодняшний день 86% Protein Data Bank (rcsb-PDB) записи макромолекулярных структур, которые были определены с помощью рентгеновской кристаллографии.
Для получения кристаллов подходит для кристаллографических исследований, макромолекулы (например, белки, нуклеиновые кислоты, белок-белкового комплекса или белково-нуклеиновых кислот комплекса) должны быть очищены до гомогенного состояния, или как можно ближе к однородности. Однородности подготовки является ключевым фактором в получении кристаллы, которые преломляют с высоким разрешением (Bergfors, 1999; Макферсон, 1999).
Кристаллизация требует приведения макромолекулы пересыщения. Выборка должна быть сосредоточена в максимально возможной концентрации, не вызывая агрегации или осаждения макромолекулы (обычно 2-50 мг / мл). Введение образца осадителя может способствовать зарождению кристаллов белка в решение, которое может привести к большим трехмерным выращивания кристаллов из раствора. Есть два основных метода получения кристаллов: диффузии пара и пакетного кристаллизации. В диффузии водяного пара, капли, содержащие смесь осадителя и белковых растворов запечатывается в камере с чистой осадителя. Водяной пар затем диффундирует из падают осмолярность падение и осадителя равны (рис. 1А). Обезвоживания падение причины медленного концентрации белка и осадителя, пока равновесие достигается, в идеале в кристалле зоне зарождения фазовой диаграммы. Партия метод основан на ввоз белок непосредственно в зоне зарождения, смешивая белки с соответствующим количеством осадителя (рис. 1В). Этот метод обычно проводится под парафином / смесь минерального масла, чтобы предотвратить распространение воды из капли.
Здесь мы покажем два вида экспериментальной установки для диффузии пара, висячей капли и, сидя капли, в дополнение к партии кристаллизации в масле.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы расскажем и продемонстрировать общие текущие протоколы для кристаллизации белков. Так как это многоступенчатая процедура Есть несколько соображений, нужно быть в курсе. При работе с очень малых объемах (0,5-2 мкл), сушки капли за счет испарения является основной проблемо…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана следователь Burroughs Wellcome награду Ю.М. и Brown-Кокс Докторантура стипендий из Йельского университета Мэриленд.
Materials
| New Item | ||||
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
Referências
- Bergfors, T. M. . Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).
- Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).
- Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens. Proteins. 51, 562-568 (2003).
- Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels. Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).
- McPherson, A. . Crystallization of biological macromolecules. , (1999).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).
