Nós descrevemos um método simples, rápido e robusto para a formação de Candida albicans Biofilmes usando 96 placas de microtitulação bem e sua utilidade em testes de susceptibilidade antifúngica de células dentro de biofilmes.
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Artigo de método
A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Candida albicans continua a ser a causa mais freqüente de infecções fúngicas em uma população em expansão de pacientes comprometidos e candidíase é agora o terceiro mais comum de infecção nos hospitais dos EUA. Diferentes manifestações da candidíase são associados com a formação de biofilme, tanto em tecidos do hospedeiro e / ou dispositivos médicos (cateteres, por exemplo). Formação de biofilme carrega negativas implicações clínicas, como as células dentro do biofilme estão protegidos das respostas imune do hospedeiro e da ação de antifúngicos. Nós desenvolvemos um modelo simples, rápido e robusto in vitro para a formação de C. biofilmes albicans utilizando 96 poços de microtitulação-pratos, que também pode ser usado para testes de susceptibilidade antifúngica do biofilme. A leitura deste ensaio é colorimétrico, baseado na redução de XTT (um sal de tetrazólio) por células metabolicamente ativas biofilme fúngicas. Um experimento típico dura cerca de 24 h para a formação de biofilme, com 24 h adicionais para testes de susceptibilidade antifúngica. Devido à sua simplicidade e à utilização de materiais de laboratório comumente disponíveis e equipamento, esta técnica democratiza pesquisa biofilme e representa um passo importante para a padronização dos testes de susceptibilidade antifúngica de biofilmes de fungos.
Protocolo
1. Preparação de C. albicans
C. albicans é um microorganismo 1/BSL1 Risk Group. Lembre-se sempre ao bom uso de técnicas assépticas / estéril para trabalhar com este microorganismo e seguir os procedimentos institucionais para o descarte adequado de materiais de risco biológico.
- Prepare uma cultura overnight de C. albicans em YPD médio (Yeast peptonada Dextrose) líquido através da inoculação de uma única colônia de C. albicans em 25 mL de YPD.
- Incubar a cultura em um shaker orbital (cerca de 180 rpm) a 30 ° C durante a noite. Mais C. albicans cepas vai crescer como células d....
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Discussão
Aqui nós descrevemos um método simples, rápido, econômico e altamente reprodutível 96 modelo da placa de microtitulação bem para a formação de biofilmes de Candida juntamente com um método colorimétrico que mede a atividade metabólica de células dentro do biofilme usando XTT. Este modelo de 96 placa de microtitulação bem para a formação de biofilme foi originalmente desenvolvido para C. albicans, mas pode ser usado para outras Candida spp. e facilmente adaptado para outros organismos fúngicos........
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Divulgações
JLL-R possui capital em MicrobeHTS Technologies, Inc., que está desenvolvendo antifúngicos. MicrobeHTS Technologies, Inc. não forneceu apoio financeiro para estes estudos.
Agradecimentos
Biofilme relacionadas ao trabalho no laboratório é financiado por verbas numeradas e R21DE017294 R21AI080930 do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial e do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (para JLL-R.). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIDCR, o NIAID ou o NIH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar Sabouraud-dextrose | BD Biosciences | 211584 | Para preparar placas para subculturas frescas de isolados fúngicos |
| YPD: Extrato de levedura, peptona e dextrose | US Biological | Y2076 | Meio para propagação de culturas líquidas de crescimento noturno |
| RPMI-1640 sem bicarbonato de sódio suplementado com L-glutamina | Cellgro | 50-020-PB | Meio líquido para formação de biofilmes |
| Ácido morfolinopropanossulfônico (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | Para tamponar o RPMI 1640 |
| Solução salina tamponada com fosfato, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Tampão para lavagens |
| Sal sódico de XTT | Sigma-Aldrich | X4251 | Ver acima as instruções de preparação |
| Lactato de Ringer’s | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | Para preparação da solução de XTT |
| Menadiona | Sigma-Aldrich | M5625 | Atenção: perigoso por contato dérmico, inalação ou ingestão |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Tubos cónicos de centrífuga de 15 ml | Corning | 430790 | |
| Tubos cónicos de centrífuga de 50 ml | Corning | 430828 | |
| Placas de microtitulação de 96 poços: Poliestireno, fundo plano, tratadas para cultura de tecidos | Corning | 3595 | |
| Pipeta multicanal e ponteiras | Eppendorf | ||
| Estufa de incubação | Qualquer fornecedor | ||
| Leitora de placas de microtitulação | Qualquer fornecedor |
Referências
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A.
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Reimpressões e permissões
