成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

Summary

逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、マラリア原虫を抱いているハマダラカ蚊、にdsRNAを注入するDimopoulosラボで使用される方法を示しています。インジェクションのセットアップを操作し、胸部にdsRNAを注入する手法が示されている。

Abstract

逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、マラリア原虫を抱いているハマダラカ蚊、にdsRNAを注入するDimopoulosラボで使用される方法を示しています。インジェクションのセットアップを操作し、胸部にdsRNAを注入する手法が示されている。

Protocol

蚊におけるRNAiによる遺伝子サイレンシングは、目的の遺伝子を標的と特定のdsRNAの事前準備と浄化が必要です。 dsRNAの合成のため、我々は、in vitro転写反応での T7 RNAポリメラーゼを介したを利用するAmbion社のMegascriptキットをお勧めします。 dsRNAの精製のために、我々は、キアゲンをRNeasyキットをお勧めします。 dsRNAのサンプルを定量化して、水の3μg/μLのために調整する必要が?…

Discussion

遺伝子サイレンシングの効率が大きく変化すると細胞や臓器によって転写とタンパク質のターンオーバー率、およびdsRNAの取り込み効率を含む多くの要因に依存します。私たちは、サイレンシングは、1日の注射後には早くも始まり、6日後に注射するまで持続できることを見出した。定量PCRとウェスタンサイレンシングを検証するためにブロッティングなどの転写産物とタンパク質の検出方法を使用してくだ…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos