Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Summary

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

Abstract

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

Protocol

RNAi mediada por silenciamiento de los genes de los mosquitos requiere preparación previa y la purificación de dsRNAs específicas que se dirigen al gen de interés. Para la síntesis de dsRNA, se recomienda el kit Megascript Ambion que hace uso de un ARN polimerasa T7 mediada por reacción de transcripción in vitro. Para la purificación de dsRNA, se recomienda el kit Qiagen RNeasy. Las muestras de dsRNA deben cuantificarse y ajustado a 3 mg / l en el agua. Otros materiales que se necesitan son: de…

Discussion

La eficiencia del silenciamiento génico es muy variable y depende de una serie de factores que incluyen la transcripción y las proteínas a su vez-sobre los tipos y la eficiencia dsRNA absorción por las células y órganos. Hemos encontrado que el silenciamiento se inicia tan pronto como un día después de la inyección y puede durar hasta 6 días después de la inyección. Utilizar métodos de transcripción y las proteínas de detección, como la PCR cuantitativa y Western Blot para validar el silenciamiento.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos