Protokoll för RNAi-tester på vuxna myggor (A. gambiae)

Summary

Omvänd genetiska metoder har visat sig extremt användbart för att avgöra vilka gener som underliggande motstånd mot vektor patogener i myggor. Denna video protokoll illustrerar en metod som Dimopoulos labbet att injicera dsRNA i Anopheles gambiae myggor som hyser malariaparasiten. Tekniken manipulera injektionen setup och injicera dsRNA i bröstkorgen illustreras.

Abstract

Omvänd genetiska metoder har visat sig extremt användbart för att avgöra vilka gener som underliggande motstånd mot vektor patogener i myggor. Denna video protokoll illustrerar en metod som Dimopoulos labbet att injicera dsRNA i Anopheles gambiae myggor som hyser malariaparasiten. Tekniken manipulera injektionen setup och injicera dsRNA i bröstkorgen illustreras.

Protocol

RNAi-medierad geners uttryck i myggor kräver förberedelser och rening av specifika dsRNAs som riktar genen av intresse. För dsRNA syntes, rekommenderar vi att satsen Ambion Megascript som använder sig av en T7 RNA-polymeras-medierad in vitro transkription reaktion. För dsRNA rening rekommenderar vi Qiagen RNeasy kit. Prover på dsRNA bör kvantifieras och justeras till 3 mikrogram / mikroliter i vatten. Andra material du behöver är: spetsig pincett, glasskiva, glas microcapillary nålar, microinjector (v…

Discussion

Effektivitet av geners uttryck är mycket varierande och beror på ett antal faktorer, inklusive utskrift och protein omsättning priser, och dsRNA upptag effektivitet genom celler och organ. Vi har funnit att tysta börjar så tidigt som en injektion dagen efter och kan pågå upp till 6 dagar efter injektionen. Använd utskrift och protein detektionsmetoder såsom kvantitativa PCR och Western blotting för att validera tysta.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos